本发明专利技术公开了一种猪圆环病毒II型基因工程亚单位疫苗及其制备方法和应用。其中，猪圆环病毒II型疫苗包括可溶性融合蛋白，该可溶性融合蛋白包括由大肠杆菌表达猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因得到的蛋白，猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因经过定位信号区域剪切和定点突变，定点突变包括将密码子AGA或AGG突变为CGC。应用本发明专利技术的技术方案制备的猪圆环病毒II型疫苗抗原纯度高、安全性好，免疫原性强，对猪等动物没有致病性。并且，本发明专利技术的疫苗抗原通过大肠杆菌表达，因此制备过程相对简单，成本低。
Porcine circovirus type II gene engineering subunit vaccine and preparation method and application thereof
The invention discloses a porcine circovirus type II gene engineering subunit vaccine and a preparation method and application thereof. Among them, porcine circovirus type II vaccine including soluble fusion protein, the soluble fusion protein from Escherichia coli expression of porcine circovirus type II capsid protein gene protein of porcine circovirus type II capsid protein gene localization signal after regional shear and site directed mutagenesis, including codon AGA or AGG mutation of CGC point mutation. The porcine circovirus type II vaccine prepared by the technical proposal of the invention has the advantages of high purity, good safety, strong immunogenicity and no pathogenicity to pigs and other animals. Furthermore, the vaccine antigen of the present invention is expressed by Escherichia coli, so the preparation process is relatively simple and the cost is low.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物制药
，具体而言，涉及一种猪圆环病毒II型基因工程亚单位疫苗的制备方法和应用。
技术介绍
1991年加拿大John Harding报道了断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaningmultisystemic wasting syndrome, PMWS),后经研究证实猪圆环病毒 II 型(Porcinecircovirus 2, PCV2)是该综合征的主要病原。现有研究表明 ，猪圆环病毒病(Porcine circovirus disease, PCVD)是由PCV2感染而引起的一种临床综合征，其主要症状表现为渐进性消瘦、呼吸困难急促、贫血、腹泻、黄疸、间质性肺炎、淋巴结炎及肾炎等。猪圆环病毒II型主要侵害5-12周龄断奶仔猪，而且与近年来发生的PMWS、猪皮炎与肾炎综合症(porcine dermatitis and nephropathysyndrome, F1DNS)、猪呼吸道综合征(porcine respiratory disease complex, PRDC)、A2 型先天性振颤(congenital tremor, CT)、猪增生性和坏死性肺炎(Porcine Proliferativeand necrotizing Pneumonia,PNP)、繁殖障碍(Reproductive failure)等疾病都有密切关系。PCV2的危害在于能够使感染猪只的免疫功能受到损害，导致机体抵抗力下降，经常以亚临床感染的形式出现，易被忽视。由于PCV2感染使免疫系统受到损害，容易继发或并发其它感染性疾病，造成更大危害。本病呈世界流行，从2000年我国首次发现存在此病以来，已给我国养猪业造成了相当大的经济损失。猪圆环病毒(porcine circovirus, PCV)在分类学上属圆环病毒科、圆环病毒属，是已知的最小的动物病毒之一。病毒粒子直径约17nm，呈20面体对称结构，无囊膜。PCV具有两个基因型，即:PCV1、PCV2，基因组大小约为1.76kb，含有2个主要阅读框架，其中ORFl基因产物与病毒复制酶(Itep)相关，0RF2基因产物是构成病毒衣壳蛋白(Capsid protein,简称:cap)的成分。PCVl是由Tischer等1974年首次在PK15细胞培养物中发现，对猪无致病性。PCV2是于1991年首次在加拿大猪群中发现。1998年证实该病毒具有感染性和致病性，是养猪业需要防治的病毒类型。但由于PCV2在体外培养时不产生细胞病变,病毒增殖能力差，采用传统的方法制备该病毒疫苗非常困难。用基因工程的方法制备猪圆环病毒II型(PCV2)疫苗是控制该病的重要途径。尽管目前市场上已有杆状病毒表达的PCV2基因工程亚单位疫苗的供应，但人们仍在寻求新的低成本的PCV2疫苗的制备方法。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种猪圆环病毒II型基因工程亚单位疫苗、及其制备方法和应用，以提供一种新的猪圆环病毒II型亚单位疫苗及其制备方法和应用。为了实现上述目的，根据本专利技术的一个方面，提供了一种可溶性融合蛋白。该可溶性融合蛋白包括由大肠杆菌表达猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因得到的蛋白，猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因经过定位信号区域剪切和定点突变，定点突变包括将密码子AGA或AGG突变为CGC。进一步地，定点突变的部位包括位于猪圆环病毒II型衣壳蛋白的如下至少一组氨基酸残基位点:1)第97和第99位；2)第116位；3)第180位；4)第186位；5)第222位。进一步地，定点突变的部位包括位于猪圆环病毒II型衣壳蛋白的如下氨基酸残基位点:6)第 97，99，116 位;或 7)第 97，99，180，186 位。进一步地，定位信号区域剪切包括猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因5’端剪切掉39 159bp的DNA链；优选地，69 123bp ;优选地，105bp。根据本专利技术的另一个方面，提供上述可溶性融合蛋白在制备猪圆环病毒II型疫苗中的应用。根据本专利技术的再一个方面，提供编码上述可溶性融合蛋白的DNA序列。根据本专利技术的又一个方面，提供一种载体。该载体包含上述编码可溶性融合蛋白DNA序列。根据本专利技术的又一个方面，提供一种宿主细胞。该宿主细胞包含上述载体。进一步地，该宿主细胞保藏于中国典型培养物保藏中心(地址为武汉市武汉大学)，保藏编号为CCTCC M2012474 ;保藏日期2012年11月23日，分类命名Escherichiacoli BL21/pET28a PCV2 MNdX Cap (埃希氏菌属，大肠杆菌种)。根据本专利技术的又一个方面，提供一种猪圆环病毒II型疫苗。该疫苗包括上述可溶性融合蛋白。进一步地，该疫苗包括佐剂，佐剂包括氢氧化铝胶和CpG-DNA。根据本专利技术的又一个方面，提供上述疫苗的制备方法。该制备方法包括通过上述宿主细胞培养、提取抗原蛋白，然后添加佐剂制备而来。根据本专利技术的又一个方面，提供上述猪圆环病毒II型疫苗在预防猪圆环病毒II型引起的猪相关疾病中的应用。进一步地，对21日龄的猪进行免疫注射。应用本专利技术的技术方案制备的猪圆环病毒II型疫苗抗原纯度高、安全性好，免疫原性强，且对猪等动物没有致病性。使用该疫苗免疫后的猪只增重明显提高，呼吸道疾病明显减少。并且，本专利技术的疫苗通过大肠杆菌表达，因此制备过程相对简单，成本低。附图说明构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中:图1示出了根据本专利技术实施例的变异体筛选的工程菌E.col1.BL21/pET28a-PCV2MNd Xcap诱导表达产物的SDS-PAGE结果图，其中，I泳道为E.col1.BL21/pET28a (空白对照)上清，2泳道为E.col1.BL21/pET28a PCV2MNd X cap全菌，3泳道为E.col1.BL21/pET28a PCV2MNd Xcap 全菌，4 泳道为 E.col1.BL21/pET28a PCV2MNd X cap上清，5 泳道为 E.col1.BL21/pET28aPCV2MNd X cap 上清，M 为蛋白 marker ；以及图2示出了根据本专利技术实施例的蛋白纯化产物电泳结果，其中，M泳道为蛋白质低分子量标记物；1泳道为DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析洗脱液；2泳道为20 % -40 %饱和度硫酸铵沉淀蛋白。具体实施例方式需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本专利技术。在重组疫苗研究中PCV2的Cap蛋白基因是最为重要的备选基因，因为Cap蛋白是该病毒主要的结构蛋白，含有型特异性抗原决定簇。有研究资料报道，PCV2的中和性单克隆抗体和多克隆猪抗血清都能与Cap蛋白相识别和发生中和反应。在基因工程疫苗中，重组基因工程亚单位疫苗是最为安全的疫苗，而且其免疫的效果也最为确定，只要抗原蛋白的量足够大就能产生相应的特异性抗体。根据本专利技术一种典型的实施方式，提供了一种可溶性融合蛋白。该可溶性融合蛋白包括由大肠杆菌表达猪圆环病毒II型(PCV2)衣壳蛋白(cap)基因得到的蛋白，猪圆环病毒II型本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种可溶性融合蛋白，其特征在于，包括由大肠杆菌表达猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因得到的蛋白，所述猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因经过定位信号区域剪切和定点突变，所述定点突变包括将密码子AGA或AGG突变为CGC。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：荣俊，杜元钊，范根成，韩建文，蔡联燊，
申请(专利权)人：青岛易邦生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：
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