一种以树鼩IL-6质粒为标准品的TAQMAN探针荧光定量PCR方法，包括对树鼩IL-6基因片段的克隆并测序，以克隆的树鼩IL-6基因为目标，设计TAQMANPCR引物和探针，设计实验找到最优条件下引物的退火温度、引物浓度、探针浓度，提纯树鼩IL-6质粒计算IL-6基因片段拷贝数，以计算好的树鼩IL-6质粒用10倍梯度稀释，配制拷贝数为105～108copies阳性质粒建立标准曲线，并检测其灵敏性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学领域，具体是一种以克隆的树駒IL-6质粒为标准品，在此基础上建立的TAQMAN探针实时荧光定量PCR检测方法。
技术介绍
白细胞介素6 (Interleukin6, IL-6)，又名P 2—干扰素，是一种由淋巴类及非淋巴类细胞分泌产生的具有多种生物功能的细胞因子，它可以刺激多种细胞增殖、分化，并在机体免疫应答、骨髓造血、自身免疫和机体防御等方面均起着重要作用。在抗感染过程中，IL-6是主要的促炎症细胞因子，可促进⑶4T细胞的分化及促进T细胞产生IL-2及表达IL-2受体。此外，IL-6还具有促进浆细胞分化和B细胞产生抗体的作用。树斷|(tree shrew, Tupaia belangeri)是一种生活在热带和亚热带地区的哺乳纲攀駒类的小型动物，形态酷似松鼠，是灵长类动物的近亲。由于树駒具有体型小，经济易得，易驯养，繁殖能力强，饲养管理成本低、对人类病毒易感等优点，常常用于替代或减少一些非人灵长类动物的使用，所以很早就被用作灵长类目(包括人类)的疾病动物模型。近年来研究发现，在丙型肝炎、乙型肝炎、手足口疾病、肝癌、糖尿病、肿瘤等疾病的研究中得到广泛应用。丙型肝炎由丙型肝炎病毒(HCV)感染所致，主要由血液/体液传播，占输血后肝炎的70%，HCV感染是全世界范围内造成慢性肝病的主要原因。WHO估计全球有1.7亿人感染丙型肝炎病毒。然而，到目前为止还没有相关的疫苗和有效治愈的药物，究其原因在于没有理想的小动物模型，致使其慢性感染机制不清楚，导致于HCV疫苗研制和临床治疗举步维艰。有研究表明树駒不仅可以被丙型肝炎病毒(HCV)在体内感染，而且树駒的原代肝细胞也可以在体外被感染，也有研究证实树駒有效感染HCV后，可发展为慢性肝炎、肝脂肪变性、肝纤维化、肝硬化结节及肿瘤，表明树駒是可作为模型动物用以研究丙型肝炎发病机制，预防治疗及新药研发的新型实验动物，这为HCV慢性感染机制的研究提供了良好的研 究平台。有专家证实，在慢性及重型丙型肝炎感染者血清中IL-6水平明显上升，且上升幅度与HCV病毒载量、血清中ALT水平呈正相关，同时也和病情的轻重和病程长短有密切关系。也有研究发现，在HCV感染的慢性化及肝细胞损伤过程中，IL-6起到非常重要的促进作用；在重型乙型肝炎患者血清中，也有类似变化；也有研究发现，在重症手足口病患儿血清中，IL-6较正常对照组明显升高，这可能参与了重症手足口病的病理发病过程，但目前对树駒IL-6方面的研究鲜有报道，致使缺乏对树駒动物模型免疫细胞因子方面的评价指标。
技术实现思路
鉴于现有技术的空缺，本专利技术的目的在于建立以树駒特异性IL-6基因构建的质粒为标准品的TAQMAN探针实时荧光定量PCR方法。本专利技术首先以确定树駒IL-6基因序列为目的，并根据所获得的基因序列制备标准品和标准曲线，在mRNA水平建立实时荧光定量PCR检测树駒IL-6的方法，为今后制备IL-6单克隆抗体及研究其在树駒疾病模型中的免疫调节机理奠定基础建立一种稳定性好、重复性好、灵敏度高的树駒IL-6检测方法，从细胞因子方面，进一步证实树駒是作为HCV和手足口病研究的合适的小动物模型。为HCV和EV71的感染化机制、HCV药物治疗以及疫苗研究提供一定的基础。为了达到本专利技术的上述目的，本专利技术采取荧光定量TAQMAN PCR技术，根据克隆的树駒IL-6cDNA序列，设计特异性引物和探针，建立了用于检测树駒IL-6基因表达量的标准曲线，并检测其灵敏性。本专利技术提供的技术方案如下:一种树駒IL-6构建的质粒为标准品的TAQMAN探针实时荧光定量PCR方法，包括如下步骤:(I)对树駒IL-6基因片段的克隆并测序，(2)以克隆的树駒IL-6基因片段为目标，设计TAQMAN PCR引物和探针，(3)设计实验得到引物的退火温度、引物浓度和探针浓度，并提纯树駒IL-6质粒计算IL-6基因片段拷贝数，(4)以计算好的树駒IL-6质粒用10倍梯度稀释，配制拷贝数为IO5 IO8Copies阳性质粒建立标准曲线，(5)验证本方法的重复性、稳定性和灵敏性。步骤(I)所述克隆为以经ConA (Concanavalin)诱导培养的树斷!淋巴细胞总RNA为模板，通过RT-PCR方 法克隆出树駒IL-6cDNA片段，将该片段纯化后，通过T-A克隆连接到PMT-19T质粒中，然后转化至大肠杆菌感受态细胞DH5ci中进行扩增，筛选阳性克隆子提取阳性克隆子进行纯化，获得树駒IL-6分子测定的外参照阳性质粒。步骤(2)所述引物和探针为:IL-6FP:5’ - GACAGTATTTACAAGTGCAGGGT - 3’IL-6RP:5’ - TCCAAAAGACCAGTGATGATTC - 3’IL-6Probe:5’ (FAM) - ACTGGCAAAAAACAATCTGAACCTTC-(TAMRA)3'。 步骤(3 )所述实验为:A.退火温度的确定:根据本引物和探针特点分别设计退火温度55°C、56°C、57°C、58°C以确定其最佳退火温度，以PMD-19T IL-6质粒为模板应用PCR仪进行梯度扩增:dream Mix Taq酶25uL、dH2022uL、Tupaia-1L-6FP/RP 各自 luL、模板 luL，混合均匀；95 °C 5min ；95 °C 30s,55 580C 30s,720C 45s，35个循环；72°C IOmin ;扩增产物于2.5%琼脂糖凝胶电泳检测，以58°C条件下电泳条件最清晰，条带位置正确，无非特异扩增，因此确定退火温度Tm=58°C ；B.引物浓度的确定:引物浓度:以相同条件下能够检测到的模板浓度最低，扩增产物条带单一、清晰为引物选择标准；以100nm、200nm、500nm3个不同浓度的IL_6Taqman PCR上下游引物浓度，分别用同一浓度IL-6重组质粒为模板，共分为3个反应体系列组，同时进行RT-PCR扩增；反应体系为 25uL:Realtime PCR Master Mixl2.5ul、Tupaia_IL_6FP/RP 各自 Iul、DEPC处理水 8.5ul、模板 2ul 混合均匀；95°C 3min ；95°C 30s, 58 °C 30s, 72 °C lmin, 35 个循环；72°C IOmin扩增，4°C备用；扩增产物于2.5%琼脂糖凝胶电泳检测，不同引物浓度下电泳显示:引物200nm为最低浓度；C.探针浓度的确定:以相同模板浓度下循环阈值(Ct)最小、荧光信号比(Rn)活度最大为探针选择标准；采用50nm、100nm、200nm3个探针浓度，分别用同一浓度IL-6重组质粒为模板，进行Taqman PCR 检测；反应体系为 25uL: 2X One Step RT-PCR Buffer II 12.5uL、Takara ExTaqHS0.5uL>Primer Script RT Enzyme Mix II 0.5uL、Tupaia-1L_6FP/RP各自 0.5uL、Probe溶液 0.5uL、模板 luL、Easy dilusion9uL,混合均勻；95°C 3min ；95°C 10s, 58°C 30s, 40 个循环；72°C 5分钟，4°C保存备用；观察本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种树鼩IL?6构建的质粒为标准品的TAQMAN探针实时荧光定量PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）对树鼩IL?6基因片段的克隆并测序，（2）以克隆的树鼩IL?6基因片段为目标，设计TAQMAN?PCR引物和探针，（3）设计实验得到引物的退火温度、引物浓度和探针浓度，并提纯树鼩IL?6质粒计算IL?6基因片段拷贝数，（4）以计算好的树鼩IL?6质粒用10倍梯度稀释，配制拷贝数为105?～108copies?阳性质粒建立标准曲线，（5）验证本方法的重复性、稳定性和灵敏性。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：代解杰，黄晓燕，孙晓梅，罕园园，陆彩霞，匡德宣，王文广，仝品芬，徐娟，殷安国，李晓飞，
申请(专利权)人：中国医学科学院医学生物学研究所，
类型：发明
国别省市：
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