本发明专利技术公开一种基于Allglo探针的中华按蚊击倒抗性基因突变位点的检测方法。本发明专利技术提供的专用引物，由核苷酸序列分别如SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2所示的引物1及引物2组成；所述试剂由所述专用引物、探针1（序列SEQ?ID?NO:3）、探针2（序列SEQ?ID?NO:4）及探针3（序列SEQ?ID?NO:5）组成；所述反应试剂由所述试剂和Allglo反应缓冲液组成；所述试剂盒包括所述反应试剂。本发明专利技术提供了一种高效、快捷、简便的中华按蚊kdr基因突变位点检测方法，其特异性和敏感性高，可快速准确地检测出中华按蚊kdr基因突变类型。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因突变检测
，具体涉及中华按蚊击倒抗性(kdr)基因突变位点的检测方法，尤其涉及基于Allglo探针的中华按蚊击倒抗性(kdr )基因突变位点的荧光定量PCR检测方法及试剂盒。
技术介绍
中华按蚊(Anopheles sinensis)是我国主要的传痕媒介之一,近期相关报道指出我国中部地区的中华按蚊传播能力较上世纪有了大幅度提高，其传疟能力的增强可能与本世纪以来我国中部和黄淮地区疟疾疫情爆发有密切联系。使用杀虫剂进行按蚊媒介控制是非常重要的痕疾防治手段，人类应用杀虫剂防治蚊虫已有80年余年历史，自本世纪80年代初，用拟除虫菊酯类杀虫剂处理蚊帐及喷洒灭蚊逐渐成为重要的抗疟措施之一。由于多年来杀虫剂的大量使用，传疟媒介对杀虫剂的抗性在全球范围内迅速扩散。近几年我国湖北、`江苏等中部省份的媒介抗性监测数据显示，当地中华按蚊对溴氰菊酯杀虫剂的抗性显著上升，湖北省部分地区中华按蚊对溴氰菊酯杀虫剂半数致死浓度(LC50)较1998年上升了 306倍。击倒抗性(kdr)是蚊虫对拟除虫菊酯类杀虫剂产生抗药性的分子机制之一，是由于昆虫钠离子通道蛋白第二结构域S6区段编码氨基酸序列发生突变所致，即kdr基因L1014位点(TTG)突变。研究发现，冈比亚按蚊中同时存在L1014F和L1014S突变，这些突变导致拟除虫菊酯类杀虫剂与钠离子通道蛋白上的结合位点发生变化，与杀虫剂的结合能力变弱，从而对其敏感性降低(D.Martinez-Torres, F.Chandre, M.S.Williamson,et al..Molecular characterization of pyrethroid knockdown resistance (kdr)inthe major malaria vector Anopheles gambiae s.s.1nsect Mol Biol,1998,7 (2):179-184 ；J.Pinto,A.Lynd,N.Elissa,et al..Co-occurrence of East and West Africankdr mutations suggests high levels of resistance to pyrethroid insecticidesin Anopheles gambiae from Libreville, Gabon.Med Vet Entomol,2006,20 (I):27-32) ;2007年，KimH等报道了中华按蚊kdr基因存在L1014F (TTT)和L1014C (TGT)两种突变型，突变后中华按蚊对溴氰菊酯敏感性明显降低(H.Kim，J.H.Baek, ff.-J.Lee, etal..Frequency detection of pyrethroid resistance allele in Anopheles sinensispopulations by real-time PCR amplification of specific allele (rtPASA).Pesticide Biochemistry and Physiology, 2007,87 (I):54-61 ) 因此，不同地区蚊虫击倒抗性相关基因突变频率的测定可为传疟媒介防制措施的制定提供科学依据。目前已有采用PCR和TaqMan法荧光定量PCR检测中国按蚊抗药性kdr基因突变的报道。2011年，武松等报道了中华按蚊击倒抗性突变PCR检测方法的建立(武松，马尔健，刘茜等.中华按蚊击倒抗性突变PCR检测方法的建立.中国人兽共患病学报，2011，27(11):1008-1010);中国专利 CN102373280A 和 CN102373282A 分别公开了一种中华按蚊抗药性AS-PCR检测试剂盒以及PCR-RFLP检测试剂盒，但上述PCR方法需开盖检测结果，易引起交叉污染和假阳性，需依据电泳条带强弱进行结果判定，降低试验敏感性和特异性，易错判误判，同时在电泳中需使用毒性EB染液，不利于操作人员健康；中国专利CN102373281A公开了一种中华按蚊抗药性TaqMan PCR检测试剂盒，但TaqMan探针合成复杂，价格昂贵，需在两管内用不同的TaqMan探针组合分别进行荧光定量扩增，操作和检测程序较繁琐，且检测敏感性和特异性还有待提高；此外，上述方法均需预先提取按蚊基因组DNA作为扩增模板，费时费力，检测效率低，易污染。在现场媒介监测中，迄今尚缺乏敏感性和特异性高、成本低、简便快速的中华按蚊kdr基因突变检测方法及相应试剂和试剂盒。
技术实现思路
针对现有中华按蚊kdr基因突变位点检测方法及试剂盒存在上述缺陷，本专利技术的第一个目的是提供一种检测中华按蚊击倒抗性基因突变位点的专用引物，是由核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2所示的引物I及引物2组成。本专利技术的另一目的 是提供一种检测中华按蚊击倒抗性基因突变位点的试剂，由所述专用引物、探针1、探针2及探针3组成，所述探针I的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述探针2的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述探针3的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示； 所述探针I的5’和3’末端均标记MAR基团；所述探针2的5’和3’末端均标记JUP基团；所述探针3的5’和3’末端均标记NEP基团。所述探针1、探针2以及探针3核苷酸序列中的第7位碱基C以及探针2核苷酸序列中的第12位碱基T为锁核苷酸。本专利技术的第三个目的是提供一种检测中华按蚊击倒抗性基因突变位点的反应试齐U，由所述试剂和Allglo反应缓冲液组成，所述反应试剂中，所述引物I和引物2的终浓度均为300 800nM，优选为500nM，所述探针1、探针2以及探针3的终浓度均为200 600nM，优选为400nM。本专利技术的第四个目的是提供一种检测中华按蚊击倒抗性基因突变位点的试剂盒，包括所述的反应试剂。本专利技术的第五个目的是提供所述专用引物或所述试剂或所述反应试剂或所述试剂盒在检测中华按蚊击倒抗性基因突变位点以及制备中华按蚊击倒抗性基因突变位点检测产品中的应用，其中，所述突变位点为L1014F或L1014C。本专利技术的第六个目的是提供一种中华按蚊击倒抗性基因突变位点的检测方法，步骤如下:取10 20 μ I所述反应试剂或所述试剂盒中的所述反应试剂,加入I条中华按蚊蚊腿进行Allglo探针实时荧光定量扩增，扩增结束，仪器自动进行扩增曲线分析，并根据扩增曲线进行结果判定；所述扩增反应条件如下:95°C预变性3 10min，95°C变性10 30s，60°C退火延伸20 60s，于所述退火延伸阶段采集信号，共35 45个循环；优选地，95°C预变性5min，95°C变性15s，60°C退火延伸30s，于所述退火延伸阶段采集信号，共40个循环；所述结果判定标准如下:仅FAM通道有扩增信号时，所述击倒抗性基因不含有所述突变位点，为TTG纯合野生型；仅VIC/HEX通道有扩增信号时，所述击倒抗性基因存在L1014F突变位点，为TTT纯合突变型；仅CY5通道有扩增信号时，所述击倒抗性基因存在L1014C突变位点，为TGT纯合突变型；当FAM、本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测中华按蚊击倒抗性基因突变位点的专用引物，其特征在于：由核苷酸序列分别如SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2所示的引物1及引物2组成。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：曹俊，白亮，朱国鼎，唐建霞，周华云，高琪，
申请(专利权)人：江苏省血吸虫病防治研究所，
类型：发明
国别省市：
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