利用分子标记辅助选择鹅肌肉脂肪酸性状的方法技术

本发明专利技术公开了利用分子标记辅助选择鹅肌肉脂肪酸性状的方法，属于动物基因工程技术领域。方法包括：（1）设计鹅THRSPα基因片段的特异性引物；（2）PCR扩增反应；（3）PCR扩增产物的多态性分析；（4)优胜肉鹅亲本个体的选择等步骤工艺。本发明专利技术是依据基因型进行鹅肌肉脂肪酸性状的选择，具精确度高、操作简单、选择成本低（约0.3元/只）等特点，可在肉鹅生命早期开始选择屠体性状，缩短世代间隔，加速肉鹅育种进程，每代可缩短选择时间3个月左右。该方法可在鹅品质育种领域中推广应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及动物基因工程
，具体涉及鹅肌肉脂肪酸性状相关基因的克隆及其在标记辅助选择中的应用。
技术介绍
脂肪酸是构成脂肪的重要化学物质和组织细胞的重要组成部分，肌肉脂肪中的脂肪酸组成不仅影响肉品的风味，而且与消费者健康有关。营养学研究认为，人体血脂和血胆固醇含量受饮食中脂肪酸构成的影响，其中的饱和脂肪酸引起血脂升高，而不饱和脂肪酸有降血胆固醇的作用。流传病学研究发现，饮食中的脂肪含量、脂肪酸组成与心血管疾病直接相关(Williams, 2000)。因此作为评价肌肉营养价值的重要指标之一，脂肪酸的组成已日益受到人们的重视。据报道，品种是决定肉质中脂肪酸成分变化的主要影响因素，通过培育具有优质肉用性能的畜禽品种来提高肉产品中不饱和脂肪酸含量显得尤为重要。综合评定不同品种动物肌肉中饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸组成的差异是育种选择素材群的前提。但由于肌肉脂肪酸在活体动物上很难 直接测定，常规育种方法是通过宰杀，取新鲜胸肌肉样，采用气相色谱法进行脂肪酸相对含量分析，而这种采用表现型间接对基因型进行选择的方法存在周期长、效率低、成本高等缺点，因此常规育种方法进展较慢。为此，许多研究者正在不断探索新的更为有效的动物肌肉脂肪酸性状选择技术，以改变常规选择方法的不足。分子遗传标记以物种基因突变造成DNA片段长度多态性为基础，具有许多优点:(I)可以直接探测DNA水平的差异，不受时空的限制；(2)标记数量丰富、多态性高；(3)共显性标识，可以区分纯合子与杂合子；(4)可以解释家系内某些个体的遗传变异；(5)可以鉴定不同性别、不同年龄的个体；(6)在选择肌肉脂肪酸性状的过程中，不必做昂贵的屠宰试验。由此可见，利用易于鉴定的遗传标记，在育种计划中纳入分子标记信息进行辅助选择是提高选择效率，缩短世代间隔，提高选择强度，加快遗传进展的有效手段。近年来基因组研究的迅速发展，基因聚合、基因转移等技术手段的应用使得分子标记辅助选择应用于遗传改良已成为现实，并已取得了长足进展(游小燕等，2007 ;Liu等，2008 ;Wu等，2006 ；Thue, 2002)。然而，目前国际上对于鹅肌肉脂肪酸性状的标记辅助选择还鲜有报道，也不曾提出鹅肌肉脂肪酸性状的有效评定选择方法，在鹅肌肉脂肪酸性状的分子标记选择领域尚属空白。因此建立一种评定鹅肌肉脂肪酸性状的有效分子标记方法非常必要，同时也可为具有优良肌肉脂肪酸性状的肉鹅品种选择提供可靠的依据。
技术实现思路
本专利技术目的是，针对有关利用分子标记技术选择鹅肌肉脂肪酸性状尚属空白的不足，提供一种在鹅的生命早期就可开始、准确性高、选育周期短、成本低的利用THRSP a基因分子遗传标记技术选择鹅肌肉脂肪酸性状的方法。本专利技术所述的，是在完成下列基础工作后取得的: 1)鹅肌肉脂肪酸性状THRSPa基因的克隆与多态性分析: 根据 GenBank N0.EU710582.1 鹅 THRSPa 基因序列，利用 Primer 和 Oligo 软件设计引物，上游引物序列ASF: 5 ; -GTGCTGCCTGTACCGTCCAA-3 '，下游引物序列ASR:5' -GGGAAGCAGTTACACCATCAGAG-3'，以鹅血液基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应，采用的PCR反应体系和反应条件同于
技术实现思路
中的技术方案；PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如附图说明图1所示，扩增产物特异性良好，片段大小与预期的221bp相符。分离纯化目的片段进行直接测序，结果发现在PCR扩增产物序列中包含鹅THRSPa基因的3’侧翼区部分片段，对单核苷酸多态性(SNPs)的分析结果表明，在109bp处发生一个碱基突变(C/T)(见图2)，具有CC、CT和TT三种基因型； 2)对鹅肌肉脂肪酸相对含量的测定: 采取鹅新鲜腿肌于-70°C冷冻保存，采用气质联用法测定饱和脂肪酸(包括月桂酸、豆蘧酸、十五烷酸、棕榈酸、十七烷酸、硬脂酸、花生酸和山嵛酸)与不饱和脂肪酸(包括十五碳烯酸、棕榈油酸、十七碳烯酸、油酸、二十碳烯酸、芥酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸)相对含量; 3)鹅THRSP°基因多态性与肌肉脂肪酸相对含量关联性的分析: 采用SAS9.1软件的GLM程序对THRSPa基因多态性与肌肉脂肪酸相对含量进行关联分析，不同基因型对应的各项指标以最小二乘均数土标准误(LSM±SE)表示，线性模型为:7" 二 P+Gi+Lj +(GL)ij +Sk+Eijk 其中:r"为性状的观察值，^为群体均值，Gi为基因型效应，Lj为品种效应，(GL)u为基因型与品种的互作效应，Sk为性别效应，瓦为随机残差。结果如表I所示，鹅THRSP a基因突变位点的3种基因型对肌肉脂肪酸相对含量存在不同程度的影响。其中CT基因型个体的饱和脂肪酸含量最高，与CC和TT基因型个体比较差异显著0°〈0.01或7X0.05);而CC基因型个体的不饱和脂肪酸含量最高，与CT和TT基因型个体比较差异显著0°〈0.01或/X0.05)； TT基因型个体饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸相对含量介于CT和CC基因型个体之间。 表I不同基因型浙东白鹅个体肌肉脂肪酸相对含量权利要求1.，其特征在于按以下步骤进行: (1)设计鹅THRSPa基因片段的特异性引物:根据GenBankN0.EU710582.1鹅THRSPa基因序列设计引物: 其上游引物序列为 ASF: 5' -GTGCTGCCTGTACCGTCCAA-3'； 其下游引物序列为 ASR: 5' -GGGAAGCAGTTACACCATCAGAG-3'； (2)PCR扩增反应:在待选肉鹅群体中随机选择100-200只肉鹅个体，从各个体翅静脉采集血液，按常规酚-氯仿方法提取血液基因组DNA，并采用上述引物和基因组DNA模板进行PCR扩增反应；采用的反应体系为25 u L =IOXPCR Buffer (Mg2+ plus) 2.5 u L,.2.5 mmol.171 dNTPl.0-3.0 u L, 10 u mol*L_1 ± 游引物 0.4-0.6 y L，10 y mol.L—1 下游引物 0.4-0.6 ii L，50 ng.U I/1 模板 DNA 0.5 u L, 5.0U.u L-1 rTaq 酶 0.15-0.35 u L,ddH2017.45-20.05 u L ；PCR 扩增反应条件为 95°C 预变性 5 min, 95°C 变性 30s, 50_60°C 退火30s，72oC延伸30s, 33-38次循环，72°C延伸10 min，4°C结束反应; (3)PCR扩增产物的多态性分析:取各个体PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，分离纯化约221bp的目的片段进行直接测序，分析其S NPs单核苷酸多态性，明确各个体所属的基因型； (4)优胜肉鹅亲本个体的选择:选留CC基因型的个体作为肉鹅选择亲本，淘汰CT和TT基因型的个体。全文摘要本专利技术公开了，属于动物基因工程
方法包括(1)设计鹅THRSPα基因片段的特异性引物；(2)PCR扩增反应；(3)PCR扩增产物的多态性分析；(4)优胜肉鹅亲本个体的选择等步骤工艺。本专利技术是依据基因型进行鹅肌肉脂肪酸性状的选择，具本文档来自技高网...

【技术保护点】
利用分子标记辅助选择鹅肌肉脂肪酸性状的方法，其特征在于按以下步骤进行：（1）设计鹅THRSPα基因片段的特异性引物：根据GenBank?No.?EU710582.1鹅THRSPα基因序列设计引物：?其上游引物序列为ASF:?5′?GTGCTGCCTGTACCGTCCAA?3′；其下游引物序列为ASR:?5′?GGGAAGCAGTTACACCATCAGAG?3′；（2）PCR扩增反应：在待选肉鹅群体中随机选择100?200只肉鹅个体，从各个体翅静脉采集血液，按常规酚?氯仿方法提取血液基因组DNA，并采用上述引物和基因组DNA模板进行PCR扩增反应；采用的反应体系为25?μL：10×PCR?Buffer?(Mg2+?plus)?2.5μL，2.5?mmol?L?1?dNTP1.0?3.0μL，10μmol?L?1上游引物0.4?0.6μL，10μmol?L?1下游引物0.4?0.6μL，50?ng?μL?1模板DNA?0.5?μL，5.0U?μL?1?rTaq?酶0.15?0.35μL，ddH2O17.45?20.05μL；PCR扩增反应条件为95oC预变性?5?min，95oC变性?30s，50?60oC退火?30s，72oC延伸?30s，33?38?次循环，72oC延伸?10?min，4oC结束反应；（3）PCR扩增产物的多态性分析：取各个体PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，分离纯化约221bp的目的片段进行直接测序，分析其SNPs单核苷酸多态性，明确各个体所属的基因型；（4）优胜肉鹅亲本个体的选择：选留CC基因型的个体作为肉鹅选择亲本，淘汰CT和TT基因型的个体。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李国勤，卢立志，田勇，沈军达，陶争荣，李进军，王德前，陈黎，徐坚，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：