核酸的检测制造技术

本发明专利技术涉及用于检测和表征小核酸分子（例如，RNA（例如，小RNA例如微RNA（miRNA）和小干扰RNA（siRNA））和其他短核酸分子）的组合物和方法。更具体而言，本发明专利技术涉及用于检测和定量RNA表达的方法。本发明专利技术进一步提供了miRNA和siRNA变体的检测。

【技术实现步骤摘要】
核酸的检测本申请是申请日为2007年6月1日、申请号为200780027007.0、专利技术名称为“核酸的检测”的专利技术专利申请的分案申请。
本专利技术涉及用于检测和表征核酸分子（例如，RNA（例如，小RNA例如微RNA（miRNA）和小干扰RNA（siRNA））和其他短核酸分子）的组合物和方法。更具体而言，本专利技术涉及用于检测和定量RNA表达的方法。本专利技术进一步提供了miRNA和siRNA的突变体（例如,缺失突变体）和变体的检测。专利技术背景微RNA（miRNA）是新的一类非编码RNA，其在无脊椎动物和脊椎动物基因组中编码为短的反向重复（Ambros,(2001)Cell107,823-826;Moss(2002)Curr.Biol.12,R138-R140）。miRNA是靶mRNA翻译和稳定性的调节剂，虽然大多数靶mRNA仍未鉴定。miRNA通过结合至在3'非翻译区（UTRs）中的反义互补位点而以序列特异性的方式来控制靶mRNA的翻译（Ambros,同上;Moss,同上;Lagos-Quintana等人,(2001)Science294,853-858;Lau等人,(2001)Science294,858-862;Lee等人,(2001)Science294,862-864）。miRNA还可以通过其他机制来抑制基因表达（参见，例如Pillai等人,Science309,1573-1576(2005);Humphreys等人,ProcNatlAcadSciUSA102,16961-16966(2005)）。在无脊椎动物和脊椎动物之间，几种miRNA，例如let-7RNA、miR-1、miR-34、miR-60和miR-87是高度保守的，这暗示它们可以识别具有可能保守的功能的多个位点和/或多个靶（Lagos-Quintana等人,同上;Lau等人,同上;Lee等人,同上;Pasquinelli等人,(2000)Nature408:86）。小时序RNA（stRNA）lin-4和let-7代表了一亚类通过在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditiselegans）中的遗传分析而鉴定出的miRNA，它们在发育上受到调控并且它们本身控制发育进程，例如神经元重新布线（neuronalrewiring）的时机、持久幼虫的形成、阴门的形成以及皮下细胞的终末分化。miRNA通常从60至70个核苷酸的折回RNA前体结构中切出，所述折回RNA前体结构有时在miRNA前体表达开始时（Grishok等人,(2001)Cell106,23-34;Hutvagner等人(2001)Science93,834-838;Ketting等人,(2001)GenesDev.15,2654-2659）或在非常丰富的miRNA的表达过程中被检测出（Lagos-Quintana等人,同上;Lau等人,同上;Lee等人,同上）。一般地，发夹结构前体分子的仅一条链被切除并积累，这可能是由于其受到相关蛋白质的保护而免于RNA降解。这些假定的蛋白质可能介导了翻译抑制。miRNA前体加工反应需要DicerRNaseIII和Argonaute家族成员（Grishok等人,同上;Hutvagner等人,同上;Ketting等人,同上）。除了它们对于基因表达的影响外，小RNA（例如，具有18-25个核苷酸的siRNA或miRNA）还可以用于治疗和药物发现领域（例如，药品靶或药剂）。因此，在某些情况下，重要的是大概知道在细胞中每种miRNA存在的量（例如，在治疗前、在治疗过程中或在治疗后）。此外，miRNA基因的缺失和下调与癌症（例如，B细胞慢性淋巴细胞白血病（CLL））相关，从而在本领域中产生了对于能够检测和表征miRNA表达的需要（参见，例如Calin等人,ProcNatlAcadSciUSA,99,15524-15529(2002)）。在某些情况下，也重要的是，比较miRNA在不同组织类型中的水平，或者比较在施加刺激（例如化学或物理干预）之前和之后miRNA的水平。由于相关的siRNA和miRNA可能在细胞中以少量存在，所以希望检测方法是灵敏的和特异的。此外，对于某些应用而言，可能有利的是，鉴定出适用于高通量筛选的方法，例如均相（homogeneous）方法，多重（multiplexed）方法，或适用于高度平行的自动化操作和有限的温度变化的方法。虽然miRNA在基因表达的调节中起着重要作用，但是缺少用于检测和定量miRNA表达的有效技术。用于定量miRNA的方法基于凝胶电泳。通过Northern印迹法或者通过放射性的RNA酶抗性双链体的存在来检测miRNA。Northern印迹法和芯片杂交方法具有相对较低的分析灵敏度（Krichevsky等人2003），因此需要微克量的RNA来用于分析；此外，小RNA向过滤器的转移可引起与定量的再现性有关的问题，并且通常不能修正成高通量。而且，基于RNA酶抗性的检测方法需要高放射性的探针。此外，仅仅基于探针杂交的测定法可能不提供在序列方面密切相关的同种型之间的足够的区分。备选的方法包括克隆miRNA，然后对插入片段进行测序。尽管该方法可适用于区分在密切相关的miRNA种类之间的单碱基差异，但是这种方法是耗时且费力的。与miRNA相似，小干扰RNA（siRNA）是通过称为RNA干扰（RNAi）的应答而参与细胞防御（例如，针对病毒RNA）的小RNA分子（Cullen,B.R.,NatureImmunology,3:597-599(2002)）。通过作为针对细胞中存在双链RNA的RNAi应答的一部分的Dicer酶和RNA诱导的沉默复合物（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）蛋白质复合体的作用，产生出一类siRNA（Khvorova,A.等人,Cell115:209-216(2003)）。另一类siRNA是合成的，并且包括通常21-23nt的短双链体，其具有特征性的二核苷酸突出端（Elbashir,S.M.等人,EMBOJ.20:6877-6888(2001)），其通过所引入的载体的转染或表达而被直接引入到细胞中（Paul,C.P.等人,NatureBiotechnology20:505-508(2002),美国专利申请公开号2003/0148519A1,通过提及而以其整体合并入本文以用于所有目的）。在某些情况下，siRNA似乎坚持作为确定的序列，这使得它们在功能和组成方面与miRNA相似（Elbashir,S.M.等人,同上）。需要用于检测和表征（例如定量）miRNA和siRNA水平的有效且精确的方法。专利技术概述本专利技术涉及用于检测和表征核酸分子（例如，RNA（例如，小RNA例如微RNA（miRNA）和小干扰RNA（siRNA））和其他短核酸分子）的组合物和方法。更具体而言，本专利技术涉及改进的用于检测和表征（例如定量）RNA表达的方法。例如，本专利技术提供了一种方法，其包括：使至少一种核酸（例如，其包含不与干扰RNA互补的序列）与干扰RNA靶杂交从而产生检测结构，并检测该检测结构。在一些实施方案中，干扰RNA靶为miRNA。在其他实施方案中，干扰RNA靶为siRNA。在一些实施方案中，siRNA是双链本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测miRNA靶的方法，其包括下列步骤：a)提供：i)miRNA靶；ii)第一种未标记的寡核苷酸，其包含与所述miRNA靶互补的第一区域以及与所述miRNA靶不互补的第二区域；iii)第二种未标记的寡核苷酸，其包含与所述miRNA靶的第二区域互补的第一区域以及与所述miRNA靶的所述第二区域不互补的第二区域；iv)逆转录酶；v)DNA聚合酶；以及vi)探针寡核苷酸，其中所述探针寡核苷酸的至少一部分与所述miRNA的至少一部分互补；b)在使得检测结构能够形成的条件下温育组分(i)至(vi)；以及c)检测所述检测结构。

【技术特征摘要】
2006.06.01 US 60/810,0781.用于检测miRNA靶的方法，其包括下列步骤：a)提供：i)miRNA靶；ii)第一种未标记的寡核苷酸，其由与所述miRNA靶的第一区域互补的3'部分以及与所述miRNA靶不互补的5'部分组成，其中所述第一区域包含所述miRNA靶的3'末端；iii)第二种未标记的寡核苷酸，其由与所述miRNA靶的第二区域同源的3'部分以及与所述miRNA靶的所述第二区域不同源的5'部分组成；iv)DNA聚合酶；v)探针寡核苷酸；vi)第一堆叠者寡核苷酸，其中所述第一堆叠者寡核苷酸的至少一部分与在所述第一种未标记的寡核苷酸的所述5'部分中的区域互补；以及vii)5'核酸酶；b)在使得能够达到下述情形的条件下温育组分(i)至(vii)：通过聚合酶链式反应来扩增所述miRNA靶从而形成miRNAcDNA，其中所述探针寡核苷酸的至少一部分与所述miRNAcDNA的至少一部分互补，并且其中在侵入性切割结构中所述探针寡核苷酸与所述miRNAcDNA杂交；c)用所述5'核酸酶切割在所述侵入性切割结构中的所述探针寡核苷酸；以及d)检测在所述侵入性切割结构中的所述探针寡核苷酸的切割，其中在所述侵入性切割结构中的所述探针寡核苷酸的切割是所述miRNA靶存在的指示，其中所述方法不是诊断方法。2.权利要求1的方法，其中所述5'核酸酶不具有聚合酶活性。3.权利要求2的方法，其中所述5'核酸酶为古细菌物种的FEN-1核酸内切酶。4.权利要求1的方法，其中所述第一种未标记的寡核苷酸包含这样的核酸序列，即使得在所述寡核苷酸和所述miRNA靶之间形成6-10个碱基对的双链体。5.权利要求1的方法，其中所述探针寡核苷酸是未标记的。6.权利要求1的方法，其中所述提供DNA聚合酶包括提供逆转录酶。7.权利要求6的方法，其中在所述条件下，所述第一种未标记的寡核苷酸和所述逆转录酶用于反转录所述miRNA，从而产生miRNAcDNA靶。8.权利要求1的方法，其中所述第一堆叠者寡核苷酸包含5'部分，其中所述第一堆叠者寡核苷酸的所述5'部分与在所述第一种未标记的寡核苷酸的所述5'部分中的区域互补，该在所述第一种未标记的寡核苷酸的所述5'部分中的区域邻近所述第一种未标记的寡核苷酸的与所述miRNA互补的所述3'部分。9.权利要求1的方法，该方法进一步包括提供viii)第二堆叠者寡核苷酸，其与在所述第二种未标记的寡核苷酸的所述5'部分中的区域互补。10.权利要求1的方法，其中所述检测包括使用经标记的探针。11.权利要求10的方法，其中将所述经标记的探针构造成用于FRET检测。12.第一种未标记的寡核苷...

【专利技术属性】
技术研发人员：H·T·阿拉韦，V·莱米柴夫，
申请(专利权)人：第三次浪潮技术公司，
类型：发明
国别省市：