霉菌类聚酮化合物合成基因在酵母中的异源表达制造技术

本发明专利技术涉及一种表达载体的制作方法，所述方法从真核生物具有的包含内含子的基因中除去该基因所包含的内含子，仅将外显子序列连接，从而制作包含该连接的序列的表达载体。详细而言，涉及以下方法：利用PCR从包含内含子的霉菌的巨大基因中将外显子序列作为一个或多个片段扩增，利用缺口修复克隆法将该片段及经限制性酶处理的载体连接，从而制作包含连接的外显子序列的表达载体的方法；合成巨大基因的cDNA片段并连接，制作包含全长cDNA序列的表达载体的方法；导入了利用该方法制作的表达载体的转化体；由该转化体产生的蛋白质；以及得到使用该表达载体由该蛋白质产生的化合物的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及表达载体的制作方法，所述方法从真核生物具有的包含内含子的基因中除去该基因所包含的内含子，仅将外显子序列连接，从而制作包含该连接成的序列的表达载体。详细而言，涉及以下方法:利用PCR从包含内含子的霉菌的巨大基因中将外显子序列作为多个片段扩增，利用缺口修复克隆法将该片段及限制性酶处理的载体连接，从而制作包含连接成的外显子序列的表达载体的方法；合成巨大基因的cDNA片段并连接，制作包含全长cDNA序列的表达载体的方法；导入有利用该方法制作的表达载体的转化体；由该转化体产生的蛋白质；以及得到使用该表达载体由该蛋白质产生的化合物的方法。
技术介绍
由霉菌的基因组序列的分析结果明确了在霉菌基因组上存在推定为二次代谢产物的生物合成基因的多个基因，但没有确认这些基因编码的蛋白质(二次代谢产物的生物合成酶)的生产。通常，为了获得基因组序列编码的蛋白质，需要首先制备mRNA，通过逆转录酶合成cDNA后，将该cDNA导入至表·达载体。通常而言，基因的阅读框巨大时，很可能不能合成完全长度的cDNA，因此，有时存在cDNA文库中不能覆盖的阅读框，另外，难以将基因导入与取得的生物不同的宿主中使其表达(异源表达)。目前为止，二次代谢产物用作许多药品先导化合物，作为如上所述使用的二次代谢产物，例如可以举出聚酮化合物类天然产物及肽类天然产物。已知这些天然产物分别通过聚酮合酶(polyketide synthase, PKS)及非核糖体妝合成酶(nonribosomal peptidesynthetase, NRPS)被生物合成(非专利文献1-3)。对于由霉菌基因组序列明确的、推定为二次代谢产物的生物合成基因的基因，也期待通过该基因编码的蛋白质合成的二次代谢产物的有用性。但是，由于霉菌为真核生物，所以基因中包含内含子，并且基因巨大，因此，利用如上所述的现有的方法难以合成完全长度的cDNA，不能合成推定为二次代谢产物的生物合成基因的基因编码的蛋白质。由于上述情况，迫切需要开发出从霉菌的巨大生物合成基因中除去内含子，使该基因编码的蛋白质表达的方法。非专利文献I:Leadlay, P.，et al.，Nature 1990非专利文献2:Katz, L.，et al.，Science 1991非专利文献3:SamsonS.，et al.，Nature 1985非专利文献4:Hisao Moriya, et al., PLos ONE 2010
技术实现思路
本专利技术的目的在于:从不能利用逆转录酶合成全长cDNA的霉菌的巨大基因中仅取出外显子序列并连接，制作包含该连接成的序列的表达载体；或者合成上述巨大基因的cDNA片段并连接，制作包含全长cDNA序列的表达载体；以及使用该表达载体使该基因编码的蛋白质表达。为了达成上述目的，专利技术人等利用PCR将作为霉菌的一种的球毛壳霉(Chaetomium globosum)基因组中存在的预测为推定的生物合成基因中的外显子序列的序列扩增，使这些外显子序列和限制性酶处理过的载体通过芽殖酵母中的同源重组而连接，制作表达载体，使用以酵母作为宿主的体系使该表达载体表达。即，本专利技术人等为了除去基因中的内含子序列，首次利用缺口修复克隆法，从而完成了本专利技术。即，本专利技术提供一种制作表达载体的方法，所述方法将真核生物具有的包含内含子的基因或推定为基因的基因组序列的外显子序列连接，制作包含该连接成的序列的表达载体，所述方法包括以下工序:工序(a):利用PCR，从提取自真核生物的基因组，将外显子序列作为多个片段扩>曰，这里，PCR中使用的正向引物从5’末端向3’末端的方向依次具有:与使扩增的片段连接所得的片段的有义链的3’末端部分的序列互补的序列、或与载体的限制性酶处理末端部分的有义链的3’末端部分的序列互补的序列、及与扩增的片段的有义链的5’末端部分的序列互补的序列，反向引物从5’末端向3’末端的方向依次具有:与使扩增的片段连接所得的片段的反义链的3’末端部分的序列互补的序列、或与载体的限制性酶处理末端部分的反义链的3’末端部分的序列互补的序列、及与扩增的片段的反义链的5’末端部分的序列互补的序列，通过使用这些引物，在扩增的片段的末端添加与连接在该片段上的片段的末端部分同源的序列或与载体的限制性酶处理末端部分同源的序列，及工序(b):将通过工序(a)得到的片段和经限制性酶处理过的载体同时转化至芽殖酵母或分裂酵母，由此利用同源重组得到片段和片段、及片段和载体连接成的表达载体。另外，本专利技术提供一种 制作表达载体的方法，所述表达载体包含真核生物具有的、包含内含子的基因或推定为基因的基因组序列的全长cDNA序列，所述方法包括以下工序:工序(a):从提取自真核生物的mRNA合成cDNA片段，利用PCR扩增该cDNA片段，这里，PCR中使用的正向引物从5’末端向3’末端的方向依次具有:与使扩增的片段连接所得的片段的有义链的3’末端部分的序列互补的序列、或与载体的限制性酶处理末端部分的有义链的3’末端部分的序列互补的序列、及与扩增的片段的有义链的5’末端部分的序列互补的序列，反向引物从5’末端向3’末端的方向依次具有:与使扩增的片段连接所得的片段的反义链的3’末端部分的序列互补的序列、或与载体的限制性酶处理末端部分的反义链的3’末端部分的序列互补的序列、及与扩增的片段的反义链的5’末端部分的序列互补的序列，通过使用这些引物，在扩增的片段的末端添加与连接在该片段上的片段的末端部分同源的序列或与载体的限制性酶处理末端部分同源的序列，及工序(b):将通过工序(a)得到的cDNA片段和经限制性酶处理过的载体同时转化至芽殖酵母或分裂酵母，由此利用同源重组得到片段和片段、及片段和载体连接成的表达载体。上述方法可以应用于作为真核生物的霉菌的基因，霉菌可以为青霉属(Penicilium 属)、毛壳属(Chaetomium 属)、或曲霉属(Aspergillus 属)。另外，在上述方法中，基因或推定为基因的基因组序列可以为4 20kb。进而，在上述方法中，基因或推定为基因的基因组序列可以为编码聚酮合酶或非核糖体肽合成酶的序列。在上述方法中，可以使连接成的序列为包含序列号15 21、29及47中的任一个所表示的碱基序列的多核苷酸。另外，本专利技术还提供一种导入有通过上述方法制作的表达载体的转化体。进而，本专利技术还提供一种由上述转化体产生的蛋白质。另外，本专利技术还提供一种得到化合物的方法，所述方法使用通过上述方法制作的表达载体，得到由包含内含子的基因或推定为基因的基因组序列编码的蛋白质产生的化合物。上述方法可以包括下述工序:培养导入了表达载体的转化体，从培养液或转化体中提取化合物。使用本专利技术时，能够从基因序列中除去内含子，仅使外显子连接，因此，根据本专利技术，可以说能够人为地进行剪接。另外，使用本专利技术时，能够使由于使用现有方法不能合成cDNA因而不能使其表达的、巨大基因编码的蛋白质表达。进而，通过培养导入该表达载体的宿主，也能得到由表达的蛋白质产生的化合物。对由基因组序列的信息推定为基因、但没有分离及确认其产物的序列应用本专利技术的方法时，能够合成该推定基因编码的未知蛋白质，确定该蛋白质的功能。另外，对霉菌类的基因应用本专利技术制作表达载体，使用以酵母作为宿主的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：渡边贤二，守屋央朗，
申请(专利权)人：静冈县公立大学法人，国立大学法人冈山大学，
类型：
国别省市：