用于产生由单分子DNA形成的环状DNA的方法技术

本发明专利技术提供了用于产生环状DNA的方法，所述环状DNA由单分子DNA形成的环状DNA组成，并且其不包括由多分子DNA形成的环状DNA。根据本发明专利技术的方法，可以可靠地产生仅由单分子DNA形成的环状DNA分子。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于产生仅由单分子DNA形成的环状DNA的方法、用于上述方法的新适配体和用于产生环状DNA的包含新适配体的试剂盒。本专利技术还涉及使用通过上述方法产生的单分子环状DNA来鉴定和/或检测基因的方法。特别地，本专利技术涉及鉴定和/或检测引起多种病理状态的融合基因的方法。
技术介绍
载体方法是常规基因分析方法。在载体方法中，待分析的目标基因被整合到载体中，然后利用测序仪确定扩增后得到的基因的全长序列。但是载体方法的问题在于其需要培养操作，问题还在于需要使用测序仪来分析基因的全长。近年来，已经开发出了用于基因分析的高速测序仪，并且由于这种测序仪的开发，作为基因分析手段的配对(メイ卜ペア)方法引起了注意。附图说明图1示意性示出了使用配对方法的基因分析的概況。在配对方法中，用于连接的核苷酸序列(限制性酶识别位点)与待分析的目标基因的两端相连，然后使目标基因环化。然后，通常使用II型限制性酶将限制性酶识别位点两侧的侧翼包含15或更多个核苷酸、且优选25个或更多个核苷酸至几十个或更少个核苷酸的部分从所述环化的基因上切下。将该部分通过PCR进行扩增，然后确定所切下的部分基因的核苷酸序列。从而确定目标基因两端的序列，然后可利用已知的序列数据鉴定目标基因。配对是指通过阅读单个DNA片段的两端得到的一对核苷酸序列的序列数据。从基因上切下给定数量的核苷酸的实际使用的方法包括:使用II型限制性酶切割远离识别位点之位点的方法以切割给定数量的核苷酸；和包括以下步骤的方法:利用超声等对环状DNA进行物理切 割，利用附接在接头上的生物素回收切割片段，然后通过PCR扩增该片段，然后确定扩增的PCR产物的序列。因此，通过阅读特定长度的核苷酸序列，所述核苷酸序列包含通过连接DNA的两端来环化的基因中连接位点两侧的侧翼，配对方法可以鉴定已知基因。基本上，如果阅读了基因头部和尾部的部分核苷酸序列，那么这些序列将允许在各个基因中作出可靠的区分。因此，配对方法已经被用作可靠且简单的基因分析方法(非专利文献I和2)。此外，配对方法已经被用于下一代序列分析，因此随着高速测序仪的出现，其变得更加重要。但是，当根据配对方法环化DNA来进行基因分析吋，除了单基因或单DNA(单个分子)的自环化外，还发生多DNA(多个分子)的环化和多个分子(两个或更多个分子)的线性结合。通过随后的操作，可以从环状分子中分离和除去由多个分子组成的线性分子。另一方面，无法将由多个分子组成的环状分子与由单个分子组成的环状分子分离，由多个分子组成的环状分子变成了污染物。由于以下原因，由多个分子组成的环状产物抑制了単独基因的分析并且显著降低了分析的特异性。特别地，如图2所示，当三种类型的cDNA自环化时，如果如(B)所示仅单分子DNA环化，根据配对方法可使用确切的序列来指明基因。但是，除了如(B)所示单分子的环化外，如(C)所示可产生未环化的线性产物，或如(D)所示两个或更多个cDNA可能发生环化。在(C)的情况下，可利用DNA外切酶除去线性产物。但是，在(D)的情况下，由多个cDNA组成的环化产物被识别为环状分子，因此无法除去并且成为根据配对方法的基因分析中的污染物。根据配对方法的基因分析意在根据目标基因两端的核苷酸序列来鉴定目标基因。具体地，将用于环化的连接适配体附接到单个基因的两端，然后将两个适配体位点彼此连接来使基因环化。然后，从所述基因上切除以适配体位点为中心在两侧包含特定数量的核苷酸的部分。由此，通过分析来源于原始基因每一端之部分的核苷酸序列，可以鉴定所述基因。因此，多个分子的环化产物具有多个适配体位点，与适配体附接的两端是不同基因的两端。因此，如上所述，根据上述两种方法中的任ー种，因为通过切下以适配体为中心的附接于适配体两端的包含给定数量核苷酸的核苷酸序列的部分来进行基因分析，所以由多个分子的环化产物得到的用于分析的基因片段包含不同基因的末端。因此，不能够进行单基因的分析。 因此，在根据配对方法的基因分析中，多个分子的环化产物的存在抑制每个基因的分析。根据所采用的方法，多个DNA分子环化的可能性一般为极少量至百分之十几。在已知基因的分析中，它们被识别为异常的核苷酸序列，因此，通常可以将其从待分析序列中除去。因此，尽管操作变得复杂，但是其仅造成精确度的稍微下降。但是，在使用配对方法检测正常基因的组中异常基因(如融合基因)存在的情况下，如果多个正常基因环化，就确定为存在异常基因。因此，就变得无法正确确定异常基因(如融合基因)的存在。融合基因是通过多个(两个)基因彼此结合而构成的具有新功能的基因。例如，在癌细胞中发现的染色体结构畸形，如缺失、重叠、重组和易位。当在DNA水平发生基因切割和连接并且在每个切割位点存在结构基因时，就形成了融合基因。一般而言，融合基因对于细胞是致死的或无意义的，其在很多情况下并不造成临床问题。但是，当由融合基因产生的融合蛋白抑制对细胞生长的控制从而导致细胞生长异常加速吋，就造成临床问题，如形成肿瘤。过去认为融合基因主要在造血系统肿瘤中表达。但是，近年来，预期融合基因还与上皮实体肿瘤相关联(非专利文献3)。在这些实体癌中，从前列腺癌和肺癌中发现了典型的融合基因(非专利文献4和5)。通过这些发现，融合基因的分析(融合基因的存在的确定)作为诊断肿瘤(癌症)等的新方法引起了注意。特别地，通过检测已知对应于病理状态的已知融合基因，能够快速诊断病理状态。此外，新融合基因的发现导致发现药物之靶标的发现。另ー方面，在实体肿瘤上进行的常规染色体分析具有一些缺点并且极其难于分析和/或确定融合基因。近年来，已经开发出了新方法，例如Mano等人的cDNA功能化表达分析方法。但是，这些技术依然具有操作复杂、精确性方面的问题等不足(专利文献I)。另外，最近开发了多种下一代高速基因测序仪。因此，基因的高速序列分析已经显著进步，并且已经实现了短时间的基因分析。因此，根据肿瘤基因和/或基因的高速和/或大規模核苷酸序列分析的融合基因研究已经开始(非专利文献6)。为了通过使用配对方法的序列分析来鉴定融合基因，需要可靠地产生来自单cDNA分子的单环状DNA。图3示出了根据配对方法的融合基因分析的示意图。但是，在一些情况下，如图4所示，可能由多个cDNA分子形成单个环状DNA。因此，在根据配对方法进行序列分析时，可能获得正常基因看上去是融合基因的結果。如果由于在常规基因序列中不存在此基因的原因而除去此基因的话，那么也除去了融合基因。因此，变得基本不可能确认融合基因的存在。当根据配对方法的序列分析检测融合基因时，除去多个基因的环状DNA是必需的。引用列表专利文献专利文献1:日本专利N0.4303303非专利文献:非专利文献1:Tanpakushitsu Kakusan Koso, August2009, (1233-1247,1271-1275)非专利文献2: Shikkan Idenshi no Tansaku to ChokosokuSequence, Jikken Igaku extra edition,Vol.27,N0.12 (2009,113 (1929)-143 (1959))非专利文献3:Mitelman et al., 2004, Nature Genet本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于产生环状DNA的方法，所述环状DNA仅由单分子DNA形成的环状DNA组成，并且其不包含由多分子DNA形成的环状DNA，所述方法包括以下步骤：1)使每个目标DNA分子的一端与用于第一环化的适配体(A)结合并且使其另一端与用于第二环化的包含适配体(b)和适配体(A)的适配体(B)结合的步骤，其中适配体(B)通过适配体(b)侧与所述DNA分子结合，从而使得适配体(B)中的适配体(A)位于所述DNA分子与适配体(b)之键的外侧，其中适配体(A)包含切割位点，所述切割位点产生与适配体(A)的全部切割末端非特异性结合的切割末端，和适配体(b)包含切割位点，所述切割位点产生仅与相同适配体(b)的切割末端特异性结合的切割末端；2)在适配体(A)的切割位点切割在步骤1)中得到的DNA分子的第一切割步骤；3)使在步骤2)中得到的DNA分子的两端结合以环化所述DNA分子的第一环化步骤；4)除去步骤3)中未环化的线性单分子和多分子结合之DNA的步骤；5)在适配体(b)的切割位点切割在步骤3)和步骤4)中得到的环状DNA分子的第二切割步骤；和6)使在步骤5)中得到的DNA分子的两端结合以环化所述DNA分子的第二环化步骤。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.09.02 JP 2010-1967191.一种用于产生环状DNA的方法，所述环状DNA仅由单分子DNA形成的环状DNA组成，并且其不包含由多分子DNA形成的环状DNA，所述方法包括以下步骤: 1)使每个目标DNA分子的一端与用于第一环化的适配体(A)结合并且使其另一端与用于第二环化的包含适配体(b)和适配体(A)的适配体(B)结合的步骤，其中适配体(B)通过适配体(b)侧与所述DNA分子结合，从而使得适配体(B)中的适配体(A)位于所述DNA分子与适配体(b)之键的外侧，其中 适配体(A)包含切割位点，所述切割位点产生与适配体(A)的全部切割末端非特异性结合的切割末端，和 适配体(b)包含切割位点，所述切割位点产生仅与相同适配体(b)的切割末端特异性结合的切割末端； 2)在适配体(A)的切割位点切割在步骤I)中得到的DNA分子的第一切割步骤； 3)使在步骤2)中得到的D NA分子的两端结合以环化所述DNA分子的第一环化步骤； 4)除去步骤3)中未环化的线性单分子和多分子结合之DNA的步骤； 5)在适配体(b)的切割位点切割在步骤3)和步骤4)中得到的环状DNA分子的第二切割步骤；和 6)使在步骤5)中得到的DNA分子的两端结合以环化所述DNA分子的第二环化步骤。2.一种用于产生环状DNA的方法，所述环状DNA由单分子DNA形成的环状DNA组成，并且其不包含由多分子DNA形成的环状DNA，所述方法包括以下步骤: 1)使每个目标DNA分子的一端与用于第一环化的适配体(A)结合并且使其另一端与用于第二环化的包含适配体(b)和适配体(A)的适配体(B)结合的步骤，其中适配体(B)通过适配体(b)侧与所述DNA分子结合，从而使得适配体(B)中的适配体(A)位于所述DNA分子与适配体(b)之键的外侧，其中 适配体(A)是包含识别回文序列之限制性酶位点的双链DNAjP 适配体(B)包含适配体(b)和适配体(A)，其中适配体(b)是双链DNA，其包含彼此取向相反的相同产切ロ酶识别位点或限制性酶位点，其中适配体(b)是双链DNA，其包含在彼此取向相反的相同产切ロ酶识别位点或限制性酶位点之间具有对于每个适配体(b)来说特有的序列的双链DNA序列，如果在彼此取向相反的相同产切ロ酶识别位点或限制性酶位点切割适配体(b)，那么切割位点仅与来自相同适配体(b)的切割位点再结合； 2)利用识别适配体(A)中所包含的限制性酶位点的限制性酶切割在步骤I)中得到的DNA分子的第一切割步骤； 3)连接在步骤2)中得到的DNA分子的两端以环化所述DNA分子的第一环化步骤； 4)除去步骤3)中未环化的线性单分子和多分子结合之DNA的步骤； 5)利用识别适配体(b)中的产切ロ酶识别位点或限制性酶位点的产切ロ酶或限制性酶切割在步骤3)和步骤4)中得到的环状DNA分子的第二切割步骤；和 6)连接在步骤5)中得到的DNA分子的两端以环化所述DNA分子的第二环化步骤。3.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：水野晋一，长藤宏司，冈村孝，
申请(专利权)人：学校法人久留米大学，
类型：发明
国别省市：日本;JP