将编码具有酪氨酸酚解酶(tyrosine?phenol-lyase)活性的酶的基因导入宿主谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium?glutamicum)而得到的、具有苯酚生产能力的转化体能够以糖类为原料高效地制造苯酚。具体而言，优选包括下述步骤的方法：使该转化体在还原条件下、在含有糖类的反应液中反应；以及回收反应液中的苯酚。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及苯酚生产技木。更详细而言，本专利技术涉及为了赋予苯酚生产功能而实施了特定基因操作的棒状细菌的转化体及使用该转化体的高效的苯酚的制造方法。
技术介绍
在全球变暖和化石资源枯竭问题的背景下，已经认识到以可再生资源为原料的化学品制造与生物燃料制造并列地作为新产业生物炼制而成为实现低碳社会的重要策略，并聚焦了广泛的关注。但是，对于以可再生资源为原料的生物苯酚生产而言，与乳酸、こ醇的生产相比，从作为原料的糖类开始的代谢反应阶段非常多，因此生产率低，并且作为产物的苯酚会使细菌的增殖受到抑制或者存在由苯酚产生的细胞毒性等，基于上述理由，目前还不能进行エ业性的生产。作为苯酚的重要用途，可以列举酚醛树脂。酚醛树脂是由苯酚与醛类的加成缩合反应生成且在塑料中具有最古老历史的树脂，由于其优良的耐热性、耐久性等优点，目前仍被用于汽车用金属替代材料、半导体密封材料、电路基板等各种用途。另外，对于迄今为止的酚醛树脂而言，由于原料苯酚与醛类的反应性极高，所得到的高分子形成复杂的三维网状结构，因此，难以实现聚合物的精密结构设计和在纳米材料中的发展，从而认为难以应用于高附加价值的用途。但是近年来，随着高分子的物性理论和仿真技术的快速发展，只要使网状结构精密化则能够由酚醛树脂创制高功能性材料。在这样的背景下，日本的酚醛树脂生产量正在逐年増加。目前的苯酚的エ业生产法(异丙苯法)是以石油来源的苯和丙烯作为原料、需要大量的溶剂类和大量的热能的 、典型的化学エ业的高能耗型エ艺。因此，从保护地球环境和減少温室效应气体的观点出发，当务之急是开发ニ氧化碳排放少的节能型的、能够由可再生资源制造的、废弃物排放低的环境和谐型エ艺，即建立生物苯酚制造技木。迄今为止尚未报道过自然界中的苯酚生产菌。作为利用基因重组菌的苯酚生产技术，可以列举非专利文献I。非专利文献I的方法中，公开了下述技术:制作向耐溶剂性菌恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)S12株中导入成团泛菌(Pantoea agglomerans)来源的编码酪氨酸酹解酶的tpl基因而得到的菌株和向恶臭假单胞菌S12株中导入恶臭假单胞菌S12株来源的编码DAHP合成酶(3-deoxy-D-arabino_heptulosonate7-phosphate(DAHP) synthase,3_ 脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸(DAHP)合成酶)的aroF-1基因而得到的菌株来使用。另外，从向恶臭假单胞菌S12株中导入恶臭假单胞菌S12株来源的编码DAHP合成酶的aroF-1基因而得到的菌株中获取对苯丙氨酸和酪氨酸的类似物(代谢拮抗物质)即间氟-DL-苯丙氨酸(m-fluoro-DL-phenylalanine)具有抗性的菌株来使用。进而，从该菌株中获取对间氟-L-酪氨酸(m-fluoro-L-tyrosine)具有抗性的菌株来使用。然后，将这些菌株供于以葡萄糖为唯一碳源的需氧条件下的补料分批培养而生产苯酚。但是，非专利文献I的方法中，苯酚的生产率在实用上不充分。现有技术文献非专利文献非专利文献I:Applied and Environmental Microbiolology, Vol.71, 2005, 8221-8227.
技术实现思路
专利技术所要解决的问题本专利技术的课题在于提供能够以糖类为原料高效地制造苯酚的微生物及使用该微生物、能够以糖类为原料高效地制造苯酚的方法。用于解决问题的手段为了解决上述问题，本专利技术人反复进行了研究，得到下述发现。(i)棒状细菌对苯酚具有高耐性。(ii)向棒状细菌中导入酪氨酸酚解酶基因而得到的转化体高效地生产苯酚。(iii)该转化体中，存在于宿主棒状细菌的染色体上的预苯酸脱水酶基因和/或苯酚2-单加氧酶基因被破坏或发生缺陷吋，能够更高效地生产苯酚。(iv)该转化体中，DAHP合成酶基因和/或分支酸变位酶基因以比转化前的宿主基因的表达水平高的水平进行表达时，能够更高效地生产苯酚。(V)该转化体在还原条件下的反应液中实质上不增殖的状态下进行反应时，苯酚生产效率比在需氧性的反应液中增殖并反应时高。本专利技术是基于上述发现而完成的，其提供下述转化体及苯酚的制造方法。第I项.ー种具有苯酚生产能力的转化体，其通过将编码具有酪氨酸酚解酶(tyrosine phenol-lyase)活性的酶的基因导入宿主棒状细菌而得到。第2项.如第I项所述的转化体，其中，编码具有酪氨酸酚解酶活性的酶的基因为成团泛菌(Pantoea agglomerans)来源的基因、布氏朽1檬酸杆菌(Citrobacter braakii)来源的基因、哥本哈根脱亚硫酸菌(Desulfitobacterium hafniense)来源的基因、橙色绿屈接菌(Chloroflexus aurantiacus)来源的基因、点型念珠蓝细菌(Nostoc punctiforme)来源的基因或齿垢密螺旋体(Treponema denticola)来源的基因。第3项.如第I项所述的转化体，其中，编码具有酪氨酸酚解酶活性的酶的基因为下述(a)或(b)的DNA，(a)由序列号36的碱基序列构成的DNA、由序列号39的碱基序列构成的DNA、由序列号42的碱基序列构成的DNA、由序列号45的碱基序列构成的DNA、由序列号48的碱基序列构成的DNA或由序列号51的碱基序列构成的DNA，(b)在严格的条件下与由(a)中任一个碱基序列的互补碱基序列构成的DNA杂交且编码具有酪氨酸酚解酶活性的多肽的DNA。 第4项.如第I 3项中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌为存在于其染色体上的下述(c)和/或(d)的基因被破坏或发生缺陷的棒状细菌，(c)编码具有预苯酸脱水酶(prephenate dehydratase)活性的酶的基因，(d)编码具有苯酹2-单加氧酶(phenol2_monooxygenase)活性的酶的基因。第5项.如第I 4项中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌的下述(e)和/或(f)的代谢基因在宿主中高表达，(e)编码具有 DAHP 合成酶(3-deoxy-D-arabino_heptulosonate7-phosphate (DAHP) synthase，3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸(DAHP)合成酶)活性的酶的基因，(f)编码具有分支酸变位酶(chorismate mutase)活性的酶的基因。第6项.如第I 5项中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌为谷氨酸棒杆菌。第7项.如第6项所述的转化体，其中，宿主谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌R(FERMP-18976)、ATCC13032 或 ATCC13869。第8项.如第6项所述的转化体，其中，宿主谷氨酸棒杆菌为存在于谷氨酸棒杆菌R(FERM P-18976)、ATCC13032或ATCC13869的染色体上的下述(c)和/或(d)的基因被破坏或发生缺陷的谷氨酸棒杆菌，(c)编码具有预苯酸脱水酶(prephenate dehydratase)活性的酶的基因，(d)编码具有苯酹2-单加氧酶(phenol2_monooxygenase)活性的酶的基因。第9项.如第6或8项所述的转化体，其中，宿主谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌R(FERM P-18976)、ATCC本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.09.08 JP 2010-2014451.一种具有苯酚生产能力的转化体，其通过将编码具有酪氨酸酚解酶活性的酶的基因导入宿主棒状细菌而得到。2.按权利要求1所述的转化体，其中，编码具有酪氨酸酚解酶活性的酶的基因为成团泛菌(Pantoea agglomerans)来源的基因、布氏朽1樣酸杆菌(Citrobacter braakii)来源的基因、哥本哈根脱亚硫酸菌(Desulfitobacterium hafniense)来源的基因、橙色绿屈挠菌(Chloroflexus aurantiacus)来源的基因、点型念珠蓝细菌(Nostoc punctiforme)来源的基因或齿垢密螺旋体(Treponema denticola)来源的基因。3.按权利要求1所述的转化体，其中，编码具有酪氨酸酚解酶活性的酶的基因为下述(a)或(b)的 DNA， (a)由序列号36的碱基序列构成的DNA、由序列号39的碱基序列构成的DNA、由序列号42的碱基序列构成的DNA、由序列号45的碱基序列构成的DNA、由序列号48的碱基序列构成的DNA或由序列号51的碱基序列构成的DNA， (b)在严格的条件下与由(a)中任一个碱基序列的互补碱基序列构成的DNA杂交且编码具有酪氨酸酚解酶活性的多肽的DNA。4.按权利要求1 3中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌为存在于其染色体上的下述(c)和/或(d)的基因被破坏或发生缺陷的棒状细菌， (c)编码具有预苯酸脱水酶活性的酶的基因， (d)编码具有苯酚2-单加氧酶活性的酶的基因。5.按权利要求1 4中任一项所述的转化体，其中，宿主棒状细菌的下述(e)和/或(f)的代谢基因在宿主中高表达， (e)编码具有DAHP合成酶...
【专利技术属性】
技术研发人员：汤川英明，乾将行，
申请(专利权)人：绿色苯酚·高机能苯酚树脂制造技术研究组合，
类型：
国别省市：
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