本发明专利技术涉及一种促卵泡生成激素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法和检测方法，试剂盒包括：第一试剂：含异硫氰酸荧光素标记的促卵泡生成激素抗体的溶液；第二试剂：含碱性磷酸酶标记的促卵泡生成激素抗体的溶液；磁分离试剂：含包被着异硫氰酸荧光素抗体的磁微粒的悬浮液。本发明专利技术还公开了该试剂盒的制备方法和采用该试剂进行促卵泡生成激素的检测方法。相对于现有技术，本发明专利技术准确性更好、精密度更高、灵敏度更高，而且待测样本无需预稀释，操作简单省时，检测范围宽，并且成本低。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，尤其涉及。
技术介绍
促卵泡生成激素(Follicle Stimulating Hormone, FSH)是由垂体前叶分泌的糖蛋白激素，其分子量大约为30，000，由两条多肽链(B卩α和β亚单位组成)，FSH的α亚单位由92个氨基酸残基组成，并与LH、TSH和hCG的α亚单位的结构相同，β亚单位在上述激素之间是不同的，从而赋予各激素各自的生物及免疫学特性。其主要功能是促进卵巢的卵泡发育和成熟，主要为促进卵泡颗粒层细胞增生分化，促进整个卵巢长大。其作用于睾丸曲细精管时可促进精子形成。FSH与LH协同作用促进排卵等作用。在女性中，LH在卵泡期与FSH—起促进卵泡的成熟、雌性激素的合成和分泌；促进排卵和使排卵后的卵泡转变为黄体，促进间质的生长；并促进黄体合成和孕激素与雌性激素的分泌。因此女性的FSH分泌具有明显的周期性，月经周期FSH呈有规律的升高和降低，血中FSH浓度及每日由尿液排泄的FSH的量随周期变化而变化。因此FSH可用于预测排卵时间、绝经期检查、不孕症诊断和内分泌治疗的监测坐寸ο 男性体内FSH可刺激睾丸支持细胞发育，并促进产生一种能结合雄性激素的蛋白质，通过这种蛋白质，可使发育的生殖细胞获得稳定的高浓度的雄性激素，促进生殖细胞发育，并分化成为成熟的精子。男性体内FSH分泌无明显周期性，但在50岁以后略有升高。男性体内高水平的FSH会在睾丸衰退和克兰费尔特氏综合症的初期出现。此外，FSH的浓度在饥饿、肾衰竭、甲状腺机能亢进和肝硬化时也会有所提高。目前用于促卵泡生成激素(FSH)的免疫分析方法主要有酶联免疫分析法、化学发光免疫分析法等。酶联免疫分析法存在灵敏度低，线性范围窄、不易实现全自动化等方法学限制因素。化学发光免疫分析法是在酶联免疫分析法基础上发展起来的一种免疫检测技术，具有灵敏度高、检测线性范围宽、操作简便，自动化程度高等优势。目前化学发光免疫分析技术因其有上述诸多优点得到了广泛的应用。然而，在实际的免疫检测中，由于待测样品中所含的杂质成分较多，一定程度上影响了检测灵敏度和准确性，所以从复杂的样品基质中快速分离、纯化出目的待测物，是临床检验工作者面临的难题之一。磁微粒免疫检测技术是利用高分子材料合成一定粒度大小的磁性固相微粒作载体，以物理吸附、化学偶联等方法包被上具有特异性亲和力的抗体或抗原等各种免疫活性物质，具有分离速度快、效率高、可重复性好、操作简单、不影响被分离细胞或其他生物材料的生物学性状和功能等特点，在外加磁场作用下可定向运动，使得某些特殊成分得以分离、浓集或纯化。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种改进的促卵泡生成激素的定量检测方法，该方法不仅准确性好、灵敏度高，且精密度特别是分析间精密度高，此外该方法成本低。本专利技术同时还要提供一种促卵泡生成激素的定量检测所用的试剂盒，其能够以较低的成本制备得到，且能够实现促卵泡生成激素准确和高精确地定量测定。此外，本专利技术还提供一种促卵泡生成激素的定量检测所用的试剂盒的简便和低成本的制备方法。为解决以上技术问题，本专利技术采用如下技术方案一种促卵泡生成激素化学发光定量检测试剂盒，所述试剂盒包括用于化学发光免疫检测的免疫反应步骤的免疫反应试剂，特别是，所述的免疫反应试剂包括第一试剂、第二试剂和磁分离试剂，其中第一试剂含荧光素标记的促卵泡生成激素抗体、pH为7-9的缓冲液，所述荧光素标记的促卵泡生成激素抗体的浓度为O. 5! μ g/mL ；第二试剂含碱性磷酸酶标记的促卵泡生成激素抗体、pH为7-9的缓冲液，所述碱性磷酸酶标记的促卵泡生成激素抗体的浓度为O. 5^1 μ g/mL ；磁分离试剂含包被着荧光素抗体的磁微粒的悬浮液。根据本专利技术，所述的碱性磷酸酶标记的促卵泡生成激素抗体由碱性磷酸酶与促卵泡生成激素抗体通过交联剂琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧化物和2-亚氨基四氢噻吩连接构成。`根据本专利技术，所述的第一试剂中的含有荧光素标记的促卵泡生成激素抗体是能够通过成熟和稳定的工艺容易地制备的。根据本专利技术，所述包被有荧光素抗体的磁微粒的制备也是较为容易的，且现有技术已有成熟的制备工艺可以参照。例如可以通过常规的物理吸附或化学偶联包被方式制备，没有特别限制。作为本专利技术的一种优选实施方案该包被有荧光素抗体的磁微粒中，荧光素抗体与磁微粒之间相化学偶联。本领域技术人员应知晓，本专利技术的试剂盒还可以进一步包括有其它检测所需的试齐U，例如底物溶液。但是诸如底物溶液等其它试剂可以另行购买或配制，因此，虽然试剂盒中可以包括这些试剂，但它们对于本专利技术试剂盒来说并非必不可少。本专利技术采取的又一技术方案是一种所述的试剂盒的制备方法，其包括分别制备所述第一试剂、所述第二试剂以及所述磁分离试剂的步骤，其中，所述第二试剂的制备过程如下( I)使促卵泡生成激素抗体与交联剂2-亚氨基四氢噻吩在甘氨酸溶液中，室温静置反应，生成促卵泡生成激素抗体与2-亚氨基四氢噻吩的连接物，于2-8°C下保存备用；(2)使碱性磷酸酶溶液与交联剂琥珀酰亚胺基-4_[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧化物溶液混合，室温静置反应，将反应液通过G-25凝胶柱除盐，将收集到的碱性磷酸酶与琥珀酰亚胺基-4- [N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧化物的连接物于2-8°C下保存备用;(3)将步骤(I)所得溶液与步骤(2)所得溶液按照促卵泡生成激素抗体与2-亚氨基四氢噻吩的连接物与碱性磷酸酶与琥珀酰亚胺基-4_[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧化物的连接物的摩尔比为1:1 2混合，在2_8°C下反应，使生成所述的碱性磷酸酶标记的促卵泡生成激素抗体，反应结束，将反应液通过Supperdex200凝胶纯化柱纯化,选择合适的PH缓冲液调整浓度和pH值即得所述的第二试剂。进一步地，所述的促卵泡生成激素抗体、所述碱性磷酸酶的纯度均大于等于95wt%,且所述碱性磷酸酶的比活性超过lOOOu/mg，所述碱性磷酸酶的缓冲液的浓度大于等于 5mg/mlο根据一个具体方面，所述的第一试剂的制备方法如下配制含有荧光素的pH为9^10的缓冲液，然后按照荧光素与促卵泡生成激素抗体的分子比为2(Γ200:1的比例，将所述含有荧光素的pH为9 10的缓冲液与促卵泡生成激素抗体混合,混匀后，室温静置反应，然后将反应液通过G-25凝胶柱进行分离，除去游离的荧光素，得到含有荧光素标记的促卵泡生成激素抗体的溶液，接着用具有适当PH值的缓冲液调整浓度和pH，即得所述第一试剂。根据又一具体方面，所述的磁分离试剂的制备方法如下使含有羧基活性基团的磁微粒与荧光素抗体在偶联剂的存在下，室温反应2 18小时，反应结束，磁分离，去上清，用具有适当PH值的缓冲液调整pH和浓度，即得所述磁分离试剂。优选地，所述的磁微粒具有超顺磁性，每克磁微粒上所带的羧基活性基团的含量不低于O. 4毫摩尔，其直径为O. 5 2微米；所述的荧光素抗体是多克隆抗体或单克隆抗体，其纯度大于等于90wt%，稀释效价大于1:100万，所述偶联剂为碳二亚胺。本专利技术以上所述的缓冲液可以是本领域常用的那些，例如碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、TRIS缓冲液。实际实施过程中，可选择最适合的缓冲液。例如，在第一试剂、第二试剂以及磁分离试本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种促卵泡生成激素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，所述试剂盒包括用于化学发光免疫检测的免疫反应步骤的免疫反应试剂，其特征在于：所述的免疫反应试剂包括第一试剂、第二试剂和磁分离试剂，其中：第一试剂：含荧光素标记的促卵泡生成激素抗体、pH为7?9的缓冲液，所述荧光素标记的促卵泡生成激素抗体的浓度为0.5~1μg/mL；第二试剂：含碱性磷酸酶标记的促卵泡生成激素抗体、pH为7?9的缓冲液，所述碱性磷酸酶标记的促卵泡生成激素抗体的浓度为0.5~1μg/mL；磁分离试剂：含包被着荧光素抗体的磁微粒的悬浮液。
【技术特征摘要】
1.一种促卵泡生成激素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，所述试剂盒包括用于化学发光免疫检测的免疫反应步骤的免疫反应试剂，其特征在于所述的免疫反应试剂包括第一试剂、第二试剂和磁分离试剂，其中第一试剂含荧光素标记的促卵泡生成激素抗体、pH为7-9的缓冲液,所述荧光素标记的促卵泡生成激素抗体的浓度为O. 5^1 μ g/mL ；第二试剂含碱性磷酸酶标记的促卵泡生成激素抗体、PH为7-9的缓冲液，所述碱性磷酸酶标记的促卵泡生成激素抗体的浓度为O. 5^1 μ g/mL ；磁分离试剂含包被着荧光素抗体的磁微粒的悬浮液。2.根据权利要求1所述的一种促卵泡生成激素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于所述的碱性磷酸酶标记的促卵泡生成激素抗体由碱性磷酸酶与促卵泡生成激素抗体通过交联剂琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧化物和2-亚氨基四氢噻吩连接构成。3.根据权利要求1所述的一种促卵泡生成激素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于所述包被有荧光素抗体的磁微粒中，荧光素抗体与磁微粒之间相化学偶联。4.一种如权利要求1-3中任一项权利要求所述的试剂盒的制备方法，其包括分别制备所述第一试剂、所述第二试剂以及所述磁分离试剂的步骤，其特征在于所述第二试剂的制备过程如下(I)使促卵泡生成激素抗体与交联剂2-亚氨基四氢噻吩在甘氨酸溶液中，室温静置反应，生成促卵泡生成激素抗体与2-亚氨基四氢噻吩的连接物，于2-8°C下保存备用；(2 )使碱性磷酸酶溶液与交联剂琥珀酰亚胺基-4- [N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧化物溶液混合，室温静置反应，将反应液通过G-25凝胶柱除盐，将收集到的碱性磷酸酶与琥珀酰亚胺基-4_[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧化物的连接物于2-8°C下保存备用；(3 )将步骤(I)所得溶液与步骤(2 )所得溶液按照促卵泡生成激素抗体与2-亚氨基四氢噻吩的连接物与碱性磷酸酶与琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧化物的连接物的摩尔比为1:广2混合，在2-8°C下反应，使生成所述的碱性磷酸酶标记的促卵泡生成激素抗体，反应结束，将反应液通过Supperdex200凝胶纯化柱纯化,选择合适的pH 缓冲液调整浓度...
【专利技术属性】
技术研发人员：于大为，程晓蕾，
申请(专利权)人：苏州浩欧博生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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