本发明专利技术涉及一种促甲状腺激素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法和检测方法，该试剂盒包括含有荧光素标记的促甲状腺激素抗体的溶液、包被有荧光素抗体的磁微粒的悬浮液，以及含有碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体的溶液。本发明专利技术使得能够以更低成本和更高准确度和精密度对促甲状腺激素进行定量检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种结合了免疫磁微粒分离技术和化学发光免疫分析技术的促甲状腺激素(TSH)的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法和检测方法。
技术介绍
促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone, TSH)是腺垂体分泌的一种糖蛋白，分子量约28000。它由α和β两个亚单位组成。TSH的α亚单位与由垂体分泌的促黄体生成激素(luteinizing hormone,LH)和促卵泡激素(follicle-stimulating hormone,FSH),以及由胎盘产生的人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, HCG)基本相同。它们的差别主要是在β亚单位的氨基酸序列上，使得这些激素有着各不相同的生物学特性，并可以用免疫分析方法把它们区别开来。TSH的作用靶器官是甲状腺。TSH的主要功能有几个方面1.促进甲状腺生长；2.促进甲状腺的碘吸收、甲状腺过氧化物酶激活和增加合成甲状腺素的辅酶；3.促进甲状腺胶质(主要为甲状腺球蛋白)的合成和水解，分泌甲状腺激素，包括甲状腺素(T4)和三碘甲腺原氨酸(T3) ；4.促进甲状腺滤泡的增长扩散。TSH的合成和释放主要受到以下几方面的调控1.下丘脑一垂体调节系统，促甲状腺激素释放激素(TRH)促进TSH的分泌；2. —方面TSH可促进甲状腺激素的合成，另一方面甲状腺激素又通过负反馈机制调节TSH的分泌；3. TSH受昼夜节律的影响。正常情况下这些激素相互作用保持一种动态平衡，维持正常生理状态。TSH的半衰期为54分钟，每天分泌约165 μ IU，在肝脏和肾脏`代谢清除。临床检测TSH主要用于诊断甲状腺功能紊乱的各种疾病。由甲状腺本身病变引起的为原发性甲状腺功能紊乱，在负反馈机制的作用下TSH水平呈现与Τ3、Τ4相反的变化趋势，如原发性甲亢Τ3、Τ4升高而TSH低于正常水平。继发性甲状腺功能紊乱则因TSH过度刺激或含量过低引起Τ3、Τ4出现相同趋势的变化，如垂体性甲减表现为TSH与Τ3、Τ4均低于正常水平，此时常要进一步做TRH激发试验以确诊病情。检测TSH也常用于评价口服甲状腺素替代治疗的疗效，TSH较低说明用量过大，高于正常则说明用量不足。另外许多临床用药也会影响体内TSH的水平，临床评价检测结果时应予注意，例如糖皮质激素、多巴胺、一些安眠剂和生长抑素会抑制TSH分泌，使检测结果偏低；而组胺抑制剂、碘制剂和锂剂会促进TSH的分泌，使检测结果偏高。在优生优育方面，也常常要检测TSH，如怀孕妇女和婴幼儿，监测生长发育情况是否正常。目前用于检测促甲状腺激素的免疫分析方法主要有酶联免疫分析法、化学发光免疫分析法等。酶联免疫分析法存在灵敏度低，线性范围窄、不易实现全自动化等方法学限制因素。化学发光免疫分析法是在酶联免疫分析法基础上发展起来的一种免疫检测技术，具有灵敏度高、检测线性范围宽、操作简便，自动化程度高等优势。目前化学发光免疫分析技术因其具有上述诸多优点得到了广泛的应用。然而，在实际的免疫检测中，由于待测样品中所含的杂质成分较多，一定程度上影响了检测灵敏度和准确性，所以从复杂的样品基质中快速分离、纯化出目的待测物，是临床检验工作者面临的难题之一。磁微粒免疫检测技术是利用高分子材料合成一定粒度大小的磁性固相微粒作载体，以物理吸附、化学偶联等方法包被上具有特异性亲和力的抗体或抗原等各种免疫活性物质，具有分离速度快、效率高、可重复性好、操作简单、不影响被分离细胞或其他生物材料的生物学性状和功能等特点，在外加磁场作用下可定向运动，使得某些特殊成分得以分离、浓集或纯化。中国专利技术专利公开CN101949943A公开了一种了促甲状腺激素定量检测试剂盒及其制备方法，其中，试剂盒包括包被有抗促甲状腺激素单克隆抗体的磁微粒混悬液、促甲状腺激素系列校准品、辣根过氧化物酶标记的抗促甲状腺激素单克隆抗体、发光底物A液、发光底物B液以及浓缩洗液。使用该专利公开的试剂盒成功利用了磁微粒免疫检测技术实现了对促甲状腺激素的准确检测。然而，该试剂盒的制备成本和使用成本高，原因是，一方面，在进行包被有抗促甲状腺激素单克隆抗体的磁微粒混悬液的制备时，不仅过程复杂，而且直接将抗促甲状腺激素单克隆抗体包被于磁微粒上的包被率较低，导致较高的成本；另一方面，其采取辣根过氧化物酶标记的抗促甲状腺激素单克隆抗体，该抗体的制备也是非常繁琐，且标记率低，限制其检测效果和导致成本增加。此外，试剂盒在制备工艺上所存在的不易控和稳定性较差的因素，除了导致如前所述的成本增加的问题外，还使得检测的批间差大，限制了检测方法的精密度。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种促甲状腺激素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其能够以较低的成本制备得到，且能够实现促甲状腺激素准确和高精确地定量测定。本专利技术同时还提供一种一种促甲状腺激素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒的制备方法，该方法工艺稳定，成本低，且所得试剂盒的精密度高。一种促甲状腺激素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括第一试剂含荧光素标记的促甲状腺激素抗体的溶液；第二试剂含碱性磷酸酶(ALP)标记的促甲状腺激素抗体的溶液；磁分离剂含包被着荧光素抗体的磁微粒的悬浮液。优选地，该碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体由碱性磷酸酶与促甲状腺激素抗体通过交联剂4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烧-1-羧酸琥拍酰亚胺酯(Succinimidyl4-(N-Maleimidomethyl)Cyclohexane-l-Carbo, SMCC)和 2_ 亚氨基硫烧盐酸盐(2-1minothiolane HCl, 2-1T)连接构成。进一步地，所述磁微粒试剂中，包被有荧光素抗体的磁微粒由荧光素抗体与磁微粒通过偶联剂相化学偶联。进一步地，所述第一试剂中的荧光素标记的促甲状腺激素抗体的浓度为O. 5^1 μ g/mL，所述第一试剂的pH为7-9 ;所述第二试剂中的碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体的浓度为O. 5! μ g/mL,所述第二试剂的pH为7_9。本领域技术人员应知晓，本专利技术的试剂盒还可以进一步包括有其它检测所需的试齐U，例如底物溶液。但是诸如底物溶液等其它试剂可以另行购买或配制，因此，虽然试剂盒中可以包括这些试剂，但它们对于本专利技术试剂盒来说并非必不可少。本专利技术采取的又一技术方案是一种上述的促甲状腺激素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒的制备方法，其包括分别制备所述第一试剂、所述第二试剂以及磁分离剂的步骤，其中所述第二试剂的制备过程如下①将促甲状腺激素抗体加入交联剂2-亚氨基硫烷盐酸盐溶液中，室温静置后，再加入甘氨酸溶液，再次室温静置，收集活化后的促甲状腺激素抗体，于疒8°C下保存备用；②将碱性磷酸酶溶液加入交联剂4- (N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶液，室温静置，收集活化后的碱性磷酸酶，于疒8°C下保存备用；③将上述步骤①所得活化后的促甲状腺激素抗体与步骤②所得活化后的碱性磷酸酶混合，静置反应，使生成碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体，反应结束后，将反应液用Supperdex200凝胶纯化柱纯化,选择具有适当pH值的缓冲液调整浓度和pH值即得所述第二试剂；其中，所本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种促甲状腺激素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，所述试剂盒包括：第一试剂：含荧光素标记的促甲状腺激素抗体的溶液；第二试剂：含碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体的溶液；磁分离剂：含包被着荧光素抗体的磁微粒的悬浮液。
【技术特征摘要】
1.一种促甲状腺激素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，所述试剂盒包括第一试剂含荧光素标记的促甲状腺激素抗体的溶液；第二试剂含碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体的溶液；磁分离剂含包被着荧光素抗体的磁微粒的悬浮液。2.根据权利要求1所述的促甲状腺激素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于所述碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体由碱性磷酸酶与促甲状腺激素抗体通过交联剂4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯和2-亚氨基硫烷盐酸盐连接构成。3.根据权利要求1或2所述的促甲状腺激素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于所述第一试剂中的荧光素标记的促甲状腺激素抗体的浓度为O. 5^1 μ g/mL，所述第一试剂的PH为7-9 ;所述第二试剂中的碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体的浓度为O.5^1 μ g/mL，所述第二试剂的pH为7-9。4.一种如权利要求3所述的促甲状腺激素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒的制备方法，其包括分别制备所述含有荧光素标记的促甲状腺激素抗体的溶液、所述含有碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体的溶液以及所述包被有荧光素抗体的磁微粒的悬浮液的步骤，其特征在于所述含有碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体的溶液的制备过程如下①将促甲状腺激素抗体加入交联剂2-亚氨基硫烷盐酸盐溶液中室温静置后，再加入甘氨酸溶液，再次室温静置，收集活化后的促甲状腺激素抗体，于疒8°C下保存备用；②将碱性磷酸酶溶液加入交联剂4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶液，室温静置，收集活化后的碱性磷酸酶，于2l°C下保存备用；③将上述步骤①所得活化后的促甲状腺激素抗体与步骤②所得活化后的碱性磷酸酶混合，静置反应，使生成碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体，反应结束后，将反应液用 Supperdex200凝胶纯化柱纯化,选择具有适当pH值的缓冲液调整浓度和pH值即得所述第二试剂；其中，所述的促甲状腺激素抗体、所述碱性磷酸酶的纯度均大于等于95wt%，且所述碱性磷酸酶的比活性超过1000u/mg。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤①中，取促甲状腺激素抗体，加入偶联剂2-1T溶液溶解，室温静置10mirT30min，加入甘氨酸溶液，室温静置2 lOmin，...
【专利技术属性】
技术研发人员：于大为，程晓蕾，赵文姬，
申请(专利权)人：苏州浩欧博生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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