一种耐高糖β-葡萄糖苷酶-CBD融合酶及其表达基因和应用，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。与现有的β-葡萄糖苷酶相比，本发明专利技术提供的融合酶（BGL-CBD）具有以下特点：（1）纤维素结合能力强，融合酶（1μg/μL）与4%wt微晶纤维素孵育30min，98%融合酶被纤维素吸附；（2）能有效降解纤维二糖，融合酶（0.15μg/μL）在8h内对10%wt的纤维二糖降解率为95%；（3）能耐高浓度的葡萄糖，其耐糖系数Ki为1000mmol/L。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程技术及生物质利用领域，具体涉及对耐高糖β-葡萄糖苷酶和纤维素结合结构域融合及其基因的重组表达与应用。
技术介绍
随着人们生产和生活水平的提高，能源、资源和环境问题日益受到关注，利用农林废弃物制备生物能源、通过生物技术改善农林产品的品质、提高产品的附加值成为科学家关注的热点，也是发展绿色经济的希望所在。β -葡萄糖苷酶(β -glucosidase,EC3. 2.1. 21)又称β -D-葡萄糖苷水解酶、龙胆二糖酶、纤维二糖酶、苦杏仁苷酶，是一种能催化水解芳基或烃基与糖基原子团之间的糖苷键的酶(Science，2006, 311:484-489.)，因而被广泛应用纤维素水解领域。纤维素作为植物光合作用的主要多糖类物质，是地球上最为丰富的可再生资源，这在石化能源日渐枯竭的今天是一个亟待开发的天然宝库。在纤维素水解过程中，β_葡萄糖苷酶的主要作用是降解纤维二糖生成葡萄糖，从而解除酶解体系中纤维二糖对内切葡聚糖酶(EC3. 2.1. 4)和外切葡聚糖酶(EC3. 2.1. 91)活性的抑制，从而提高酶解效率并降低成本(Biotechnology Advances, 2000，18:355-383.)。目前使用的商业化纤维素酶主要来源于木霉(Trichoderma sp.),其具有高活力的内切和外切葡聚糖酶,但β -葡萄糖苷酶的活力很低，因此为了解决纤维二糖的抑制作用和提高酶解效率，在降解过程中需加入外源的葡萄糖苷酶。目前主要添加黑曲霉(Aspergillus niger)来源的β -葡萄糖苷酶(Novozymes SP188)，该酶主要是由水解酶家族3的β -葡萄糖苷酶组成，对纤维二糖具有较高的降解速率，但其耐葡萄糖系数Ki仅为3. 4mM (纤维二糖为底物)，因而随体系中葡萄糖浓度的升高，其降解纤维二糖的活力将受到极大的抑制，从而影响纤维素的连续酶解速率和效果(Biotechno logy for Biofuels, 2012, 5:31.) 另外，木霉来源的内切和外切葡聚糖酶具有很好的纤维素结合结构域，在纤维素连续降解过程中，大部分内切和外切葡聚糖酶能和没降解的纤维素结合在一起，通过过滤可以实现内切和外切葡聚糖酶的回收，因而可以直接使用在下一次的纤维素降解。但目前使用的β_葡萄糖苷酶没有纤维素结合结构域，与纤维素结合能力很弱，因此主要存在于液体中，在连续酶解过程中需再次添加β -葡萄糖苷酶，增加了成本。因此，得到具有纤维素结合能力、耐高浓度葡萄糖、能有效降解纤维二糖的葡萄糖苷酶成为了纤维素低成本降解的关键。本实验室在前期的研究中发现一个来源于Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticumDSM571的耐高糖β_葡萄糖苷酶，其具有优异的耐葡萄糖系数(Ki为600mM)和纤维二糖降解能力，并对其进行了克隆、表达研究(Biotechnology forBiofuels, 2012, 5:31.) 但是关于该β_葡萄糖苷酶与纤维素结合结构域的融合还没有文献报道
技术实现思路
解决的技术问题针对现有纤维素水解系统中β_葡萄糖苷酶在应用中的缺点，本专利技术的目的是获得一种耐高糖β -葡萄糖苷酶-CBD融合酶及其表达基因和应用。技术方案一种耐高糖β -葡萄糖苷酶-CBD融合酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。表达上述耐高糖β -葡萄糖苷酶-CBD融合酶的基因，其DNA序列如SEQ ID NO. 2所示。包含上述核苷酸序列的重组质粒。包含上述核苷酸序列的重组质粒pET-BGL-CBD。包含耐高糖葡萄糖苷酶-CBD融合酶基因的重组质粒制备方法，步骤为(I)HThermoanaerobacterium thermosaccharolyticum DSM571 的基因组为模板，以Pl和P2为引物进行PCR扩增，得到耐高糖β -葡萄糖苷酶基因的PCR扩增产物，所述引物为Pl CCCCATATGTCGGACTTTAACAAGGAC,下划线表示 Nde I 位点；Ρ2 CCCGGATCCAATGGTCCTAGTGGAAATAAG,下划线表示 BamH I 位点，并去除终止密码子；(2)将步骤(I)所得PCR 扩增产物和pET_20b分别用Nde I和BamH I双酶切，并分别割胶回收，16°C过夜连接；将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有耐闻糖β_匍萄糖昔酶基因的重组质粒pET-BGL ；(3)以Clostridium cellulovorans743B的基因组为模板，以P3和P4为引物进行PCR扩增，得到纤维素结合结构域基因的PCR产物，所述引物为P3 CCCGGATCCCCACCACCAATGTCAGTTGAATTTTACAA,下划线表示 BamH I 位点，斜体表示加入的连接肽，P4 CCCCTCGAGTGGTGCTGTACCAAGAACT,下划线 Xho I 位点；(4)将步骤(3)所得的PCR扩增产物和pET-BGL分别用BamH I和Xho I双酶切，并分别割胶回收，16°C过夜连接；将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有融合纤维素结合结构域的耐高糖β -葡萄糖苷酶的融合酶基因的重组质粒pET-BGL-CBD。包含上述重组质粒的大肠杆菌宿主细胞。上述的耐高糖β -葡萄糖苷酶-CBD融合酶在纤维二糖降解中的应用。具体方案内容为包括相关基因的克隆、基因的融合和重组表达和融合酶的定性。1.参照 NCBI 上已发表的 Τ. thermosaccharolyticum DSM571 β -葡萄糖苷酶的基因序列(登录号ΥΡ_003852393· I)设计引物，以提取的 Τ. thermosaccharolyticum DSM571基因组DNA为模板进行PCR，获得耐高糖β -葡萄糖苷酶基因全序列，并将基因克隆到pET-20b载体，得到重组质粒pET-BGL。2.参照NCBI上已发表的C. cellulovorans743B纤维素结合结构域的基因序列(登录号ZP_07630535.1)设计引物，以直接购买的C. cellulovorans743B基因组DNA为模板进行PCR，获得纤维素结合结构域的基因序列，并将该序列克隆到重组质粒pET-BGL，得到重组质粒pET-BGL-CBD。3.将重组质粒pET-BGL-CBD转化大肠杆菌JM109 (DE3)，挑单菌落到摇瓶培养基，培养至合适的浓度，加入诱导剂诱导融合酶(BGL-CBD)的表达，并利用Ni亲和层析柱进行重组酶的纯化，最终得到融合酶(BGL-CBD)的纯酶4.融合酶(BGL-CBD)的定性。融合酶BGL-CBD最适pH为6. O,最适反应温度为650C，其耐葡萄糖系数Ki为lOOOmmol/L。融合酶BGL-CBD浓度为I μ g/ μ L时，微晶纤维素浓度为4%wt时，可以吸附98%的融合酶BGL-CBD。O. 15 μ g/μ L融合酶BGL-CBD在8h内对10%wt的纤维二糖降解率为95%。有益效果与现有的β -葡萄糖苷酶相比，本专利技术提供的融合酶(BG本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种耐高糖β?葡萄糖苷酶?CBD融合酶，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种耐高糖β-葡萄糖苷酶-CBD融合酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.表达权利要求1所述耐高糖β-葡萄糖苷酶-CBD融合酶的基因，其DNA序列如SEQID NO. 2 所示。3.包含权利要求2所述核苷酸序列的重组质粒。4.包含权利要求2所述核苷酸序列的重组质粒pET-BGL-CBD。5.包含耐高糖葡萄糖苷酶-CBD融合酶基因的重组质粒制备方法，其特征在于 (I)以 Thermoanaerobacterium thermosaccharoIyticum DSM571 的基因组为模板，以Pl和P2为引物进行PCR扩增，得到耐高糖β -葡萄糖苷酶基因的PCR扩增产物，所述引物为 Pl CCCCATATGTCGGACTTTAACAAGGAC,下划线表示 Nde I 位点；Ρ2 CCCGGATCCAATGGTCCTAGTGGAAATAAG,下划线表示BamH I位点，并去除终止密码子；(2 )将步骤(I)所得PCR扩增产物和pET-20b分别用Nde I和BanH I双酶切，并分别割胶回收，16°C过夜连接；将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态...
【专利技术属性】
技术研发人员：裴建军，庞倩，赵林果，王飞，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：
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