本发明专利技术涉及青海弧菌Q67B（CCTCC?NO：M2010104）及其分离筛选和应用，属微生物学的发光细菌分离筛选和应用的技术领域，该菌是从青海省青海湖所产的青海鳇鱼体表采集到的发光菌，经分离纯化，再经温度适应性筛选，又经pH值适应性筛选，最后经毒物反应灵敏性筛选，得到的一种淡水发光菌。该菌在清洁水体中发光恒定，接触到毒物，其发光强度会明显衰减，据此可推定毒物的毒性大小及毒物的浓度。在用于地表水如内陆河流湖泊、地下水及排放污水的毒性检测时，可在10℃～37℃下进行，无需调节水样渗透压和pH值，10～15分钟内就可判别水样的毒性大小，快速、方便、灵敏。上述优点是海洋发光菌所不具备的。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及青海弧菌Q67B及其分离筛选和应用，属微生物学的发光细菌分离筛选和应用的
青海弧菌Q67B是淡水发光菌。从青海省青海湖所产的青海鳇鱼体表采集淡水发光菌，经分离、纯化、筛选后，得到一种新的淡水发光菌种菌株，16SrDNA序列分析表明，该菌属弧菌属，定名为“青海弧菌Q67B”。2010年I月28日将其送交武汉市中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO :M2010104。
技术介绍
发光菌是一大类能自身发出荧光的细菌，在条件合适时，其发光恒定。若发光菌接触到有毒有害物质时，其发光就会受抑制，抑制程度与所接触的毒物的毒性大小和毒物的浓度有关。因此发光菌可用于检测样品的生物学毒性。上世纪八十年代，发光菌就己被用于环境污染的检测。我国也于1995年发布了将发光菌用于水环境污染的毒性检测的国家标准。但不管国际还是国内，均使用来源于海洋的海洋发光菌，该发光菌适应海洋的高盐度(相当于NaCl的质量百分浓度为3%)和高渗透压的环境条件，否则无法生长，更不会发光。当用于陆地淡水样品时，必须在淡水样品中添加NaCl，直至淡水样品中NaCl的最终质量百分浓度为3%，否则淡水样品中的海洋发光菌很快就丧失发光能力，甚至细菌的细胞因低渗透压而吸水破裂，无法继续进行检测。上世纪九十年代，随着发光菌应用于环境污染的毒性检测日益增多，许多研究者发现，对有些种类的淡水样品，其检测结果往往与其它生物检测结果不太吻合，尤其是那些含有重金属盐的样品。究其原因，乃对淡水样品添加NaCl所致。所以有研究者改用葡萄糖取代NaCl来调节渗透压，使之与质量百分浓度为3%的NaCl溶液等渗，但效果并不理想，检测结果的重复性较差。这是因为海洋发光菌必需要有一定浓度的Na离子存在时才能保持良好而稳定的发光性能，缺乏Na离子的环境对海洋发光菌的发光是不利的，必然影响到海洋发光菌发光的稳定性，最终导致检测结果的严重偏差。如果使用不需要Na离子并适应较低的渗透压就能正常发光的淡水发光菌作为检测用发光细菌，对淡水样品就不必添加NaCl， 避免了应用海洋发光菌作为检测用发光细菌的不足。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是公开一种青海弧菌Q67B，其特征在于，(I)形态特征该菌的菌体呈杆状微弯，大小介于O. 5 O. 7微米X1. 5 2微米，革兰氏染色阴性，用利夫生鞭毛染色，观察到单极生鞭毛似蝌蚪状，细胞内累积聚β_羟基丁酸；(2)生理生化特征该菌适于生长的温度范围和pH范围分别为4°C 40°C和PH5 pHIO，对弧菌抑制剂2，4- 二氨基-6，7- 二异丙基喋啶敏感，具有耐盐、耐高渗透压和低渗透压的能力，能在介于质量百分浓度0% 8%之间的NaCl溶液中生长和发光；(3)基因特征16SrDNA序列AGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGTCGTGAGGAAGGTGGTGTTGTTAATAGCAGCATCATTTGACGTTAGCGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCATGCAGGTGGTGGATTAAGTCAGATGTGAAAGCCCGGGGCTCAACCTCGGAACCGCATTTGAAACTGGTTCACTAGAGTACTGTAGAGGGGGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAGATACTGACACTCAGATGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTTGGAGGTTGTGGCCTTGAGCCGTGGCTTTCGGAGCTAACGCGTTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGCGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCTACAGAATCCTGCGGAGACGCGGGAGTGCCTTCGGGAACTGTAAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTGTTTGCCAGCACGTAATGGTGGGAACTCCAGGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAGAGGGCAGCAAGCTAGCGATAGTGAGCGAATCCCAAAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGCTGCACCAGAAGTGGTTAGTTTAACCGCACTTTCTTCGGAGAGAGTGGAGGACGATCACCACGGTGTGGTTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACC。所述的青海弧菌Q67B的进一步特征在于，该菌最适于生长的温度和pH值分别为25。。和 pH9. O。本专利技术的另一个目的是推出一种分离筛选青海弧菌Q67B的方法。为实现上述目的，本专利技术采用以下的技术方案，其特征在于，该菌经过四个步骤，筛选得到第一步获取淡水发光菌，从青海省青海湖所产的青海鳇鱼体表采集到的发光菌，经分离纯化，获得淡水发光菌；第二步温度适应性筛选，在两个不同的温度下对第一步获得的淡水发光菌进行温度适应性筛选；第三步PH值适应性筛选，在两个不同的pH值下对第二步获得的淡水发光菌进行PH值适应性筛选；第四步毒物反应灵敏性筛选，用重金属盐和有机毒物对第三步获得的淡水发光菌先后进行两次毒物反应灵敏性筛选。所述的分离筛选青海弧菌Q67B的方法的进一步特征在于，所述的两个不同的温度是4°C和40。。。所述的分离筛选青海弧菌Q67B的方法的进一步特征在于，所述的两个不同的pH值是 pH5. O 和 pHll. O。所述的分离筛选青海弧菌Q67B的方法的进一步特征在于，所述的重金属盐和有机毒物分别是HgCl2和苯酚。青海弧菌Q67B具有宽的生长和发光的温度范围4°C 40°C ;具有宽的生长和发光的pH值范围pH5. O pHll. O ;具有耐盐、耐高渗透压和低渗透压的能力，能在介于质量百分浓度0% 8%之间的NaCl溶液中生长和发光；对毒物的毒性反应灵敏，特别适合用于陆地淡水样品或固体样品的水相抽提物的生物毒性快速检测和淡水样本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种青海弧菌Q67B，其特征在于，（1）形态特征：该菌的菌体呈杆状微弯，大小介于0.5～0.7微米×1.5～2微米，革兰氏染色阴性，用利夫生鞭毛染色，观察到单极生鞭毛似蝌蚪状，细胞内累积聚β?羟基丁酸；（2）生理生化特征：该菌适于生长的温度范围和pH范围分别为4℃～40℃和pH5～pH10，对弧菌抑制剂2，4?二氨基?6，7?二异丙基喋啶敏感，具有耐盐、耐高渗透压和低渗透压的能力，能在介于质量百分浓度0%～8%之间的NaCl溶液中生长和发光；（3）基因特征：16SrDNA序列：AGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGTCGTGAGGAAGGTGGTGTTGTTAATAGCAGCATCATTTGACGTTAGCGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCATGCAGGTGGTGGATTAAGTCAGATGTGAAAGCCCGGGGCTCAACCTCGGAACCGCATTTGAAACTGGTTCACTAGAGTACTGTAGAGGGGGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAGATACTGACACTCAGATGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTTGGAGGTTGTGGCCTTGAGCCGTGGCTTTCGGAGCTAACGCGTTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGCGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCTACAGAATCCTGCGGAGACGCGGGAGTGCCTTCGGGAACTGTAAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTGTTTGCCAGCACGTAATGGTGGGAACTCCAGGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAGAGGGCAGCAAGCTAGCGATAGTGAGCGAATCCCAAAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGC AACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGCTGCACCAGAAGTGGTTAGTTTAACCGCACTTTCTTCGGAGAGAGTGGAGGACGATCACCACGGTGTGGTTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACC。...
【技术特征摘要】
1.一种青海弧菌Q67B，其特征在于，(1)形态特征该菌的菌体呈杆状微弯，大小介于O.5 O. 7微米X1. 5 2微米，革兰氏染色阴性，用利夫生鞭毛染色，观察到单极生鞭毛似蝌蚪状，细胞内累积聚β_羟基丁酸；(2)生理生化特征该菌适于生长的温度范围和pH范围分别为4°C 40°C和pH5 PH10，对弧菌抑制剂2，4- 二氨基-6，7- 二异丙基喋啶敏感，具有耐盐、耐高渗透压和低渗透压的能力，能在介于质量百分浓度0% 8%之间的NaCl溶液中生长和发光；(3)基因特征16SrDNA序列2.根据权利要求1所述的青海弧菌Q67B，其特征在于，该菌最适于生长的温度和pH值分别为25°C的和pH9.0。3.一种分离筛选权利要求1所述的青海弧菌Q67B的方法，其特征在于，该菌经过四个步骤，筛选得到第一步获取淡水发光菌，从青海省青海湖所产的青海鳇鱼体表采集到的发光菌，经分离纯化，获得淡水发光菌；第二步温度适应性筛选，在两个不同的温度下对第一步获得的淡水发光菌进行温度适应性筛选；第三步PH值适应性筛选，在两个不同的pH值下对第二步获得的淡水发光菌进行PH值适应性筛选；第四步毒物反应灵敏性筛选，用重金属盐和有机毒物对第三步获得的淡水发光菌先后进行两次毒物反应灵敏性筛选。4.根据权利要求3所述的分离筛选方法，其特征在于，所述的两个不同的温度是4°C和 40。。。5.根据权利要求3所述的分离筛选方法，其特征在于，所述的两个不同的pH值是 ρΗ5· O 和 pHll. O。6.根据权利要求3所述的分离筛选方法，其特征在于，所述的重金属盐和有机毒物分别是HgCl2和苯酚。7.根据权利要求3、4、5或6所述的分离筛选方法，其特征在于，具体操作步骤第一步获取淡水发光菌(1)取新鲜的青海省青海湖所产的青海鳇鱼，截成小段，室温下放置10小时 24小时， 在暗室内检视，在发绿色荧光的亮点处，用灭菌的接种针括取，划线于培养皿内，(2)将第一步(I)所述的培养皿置于暗室中，20°C培养10小时 18小时，从中挑取发光良好的单菌落，(3)对第一步(2)所述的单菌落进行划线分离培养三 五次，取得单细胞纯培养物，转接于斜面试管，培养生长后得斜面菌种，即淡水发光菌，保存于4°C冰箱备用，(4)所述的培养皿和斜面试管内需用固体培养基，该固体培养基的配方为，MgSO4.2.47g, MgCO3 O. 79g, MgBr2 O. 09g, MgCl2 O. 109g, CaCO3 0. 103g, KCl 0. 122g, NaCl 8. 29g, Mg(HCO3)2 0. 50g，酵母膏5g，胰胨5g，甘油3g，琼脂20g，溶于IOOOmL蒸馏水中，ρΗ9· 0， 121°C灭菌20分钟，贮于4°C的冰箱备用；第二步温度适应性筛选(1)将第一步(3)所得的斜面菌种，转接于五 十支斜面试管，(2)将第二步(I)所述的斜面试管置于暗室中，20°C培养16小时 18小时，检查发光状况，选出发光良好的菌支，(3)将第二步(2)选出的菌支分别转接于五 十支斜面试管，(4)将第二步(3)所述的试管置于暗室中，20°C培养16小时 18小时，检查发光状况， 选出发光良好的菌支，(5)将第二步(4)选出的菌支分别划线转接于十个平皿，平分成两组，为第I组和第II 组，分别于4°C和40°C培养16小时 18小时，(6)另取十个平皿，平分成两组，为第III组和第IV组，每组五个平皿，暗室中挑取第I组的每一个平皿中发光良好的一个单菌落分别划线转接于第III组的五个平皿，暗室中挑取第II组的每一个平皿中发光良好的一个单菌落分别划线转接于第IV组的五个平皿，将第III组和第IV组分别于40°C和4°C培养16小时 18小时，(7)另取十支斜面试管，分别对应上述第III组和第IV组的每个平皿，将各平皿中发光良好的一个单菌落分别划线转接于十支对应斜面试管中，20°C培养16小时 18小时，(8)另取五支斜面试管，选取第二步(7)所述的十支斜面试管中发光良好的五个斜面， 分别转接到五支斜面试管中，得到五支斜面菌种，保存于4°C冰箱内备用，(9)所述的斜面试管和平皿内需用固体培养基，该固体培养基与上述的第一步需用的固体培养基完全相同，(10)经第二步温度适应性筛选操作后所得的菌种，具有耐低温4°C和耐高温40°C的性第三步pH值适应性筛选(1)取第二步的(8)所得的斜面菌种， 分别转接于pH5.O和pHll. O的液体培养基中，各为五瓶，20°C振荡培养16小时 18小时，(2)在经第三步(I)操作后的pH5.O和pHl1. O液体培养物中，各选取其中发光良好的培养物，进行交换转接，即将pH5. O液体培养基中选中的菌种转接于pHl1. O液体培养基中，而将pHll. O液体培养基中选中的菌种转接于pH5. O液体培养基中，20°C振荡培养16小时 18小时，(3)另取十个平皿，在经第三步(2)操作后的液体培养基中，分...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱文杰，
申请(专利权)人：朱文杰，
类型：发明
国别省市：
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