制备个体全蛋白质组芯片的方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种个体全蛋白质组芯片的制备方法及其应用，包括样品制备，提取样品全蛋白质组；使用蛋白质高通量分离技术，使全蛋白质组样品分别按照一定的物理、化学和/或生物性质分离成多个含有蛋白质的组份后，回收每个蛋白质样品；并根据其来源进行排序，制备出具有可寻址性质的蛋白质组芯片；根据芯片生物反应实验结果对特定蛋白质进行结构解析和功能测定。本发明专利技术还涉及上述方法制备的个体蛋白组芯片各项生物实验、功能鉴定及信号检测，包括自身抗原抗体筛选与检测、蛋白翻译后修饰检测、蛋白与蛋白、核酸及小分子相互作用检测、配体检测、药物靶点预测、酶底物谱筛选鉴定、蛋白质组比较、疾病与生命活动监测、个性化医疗等方面的应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物芯片
,具体涉及一种个体全蛋白质组芯片(IndividualProteomic Microarray, IPM)的制备方法及其应用。
技术介绍
生物芯片具有微型化、高通量、自动化等特点，可分为基因芯片、蛋白芯片、细胞芯片、组织芯片等。随着基因组计划完成，DNA与RNA的检测技术已逐步发展成熟；目前在生物芯片领域，以基因芯片为代表的各种技术平台，已经在细胞生命和代谢过程研究，疾病机理、诊断和预测，新基因的发现，新药开发，司法鉴定，环境污染监测和食品卫生监督等诸多领域获得了广泛应用。生物个体是复杂和谐的物质存在方式，而蛋白质则是生物组成结构和功能的最基本单位；因此系统性研究生物体内的全部蛋白质表达、相互作用及生物功能是当代生命科学研究的迫切需要。但是，当今国际上蛋白质芯片研究和应用总体上却大大落后于其对应的基因芯片，主要发展瓶颈是由于蛋白质样品的来源要比基因芯片困难许多。分析该局面的产生主要来自以下三方面原因首先是蛋白质组的数量要远远大于其对应的基因组数量。由于蛋白质具有复杂的剪切特性和个体化差异调节机制，而且机体不同细胞所表达的蛋白会随着所处器官、组织的不同，甚至环境状态的不同而改变甚大，研究显示人体蛋白质的数目理论上在20万以上(对应的基因组数量仅仅为3万左右)。原因之二是生物体很多蛋白质都有翻译后修饰现象以及结构不稳定以及易降解的性质，经过体外表达纯化方法得到的蛋白不但有相当一部分是缺乏正常生物功能的，而且还比较容易降解。原因之三为从原料合成层面分析，尽管理论可行，但实践中蛋白质很难在固相芯片表面合成，而基因芯片的原位合成技术在目前则已经发展得相当完善。由于上述三个主要原因，客观上造成了蛋白样品来源受限，并直接导致国际国内的蛋白质组芯片研究和应用均发展缓慢。在传统研究中，科学家往往通过克隆表达纯化的方法获得目标蛋白，但这种常规的逐一克隆表达纯化方法不仅费时费力，而且理论上也不可能完全将细胞内所有的蛋白质都表达出来。虽然现在已有通过表达纯化获得蛋白制备的蛋白质组芯片，如Life Technologies等公司推出的商业化蛋白质组芯片已经含有约9，400个蛋白质；而美国霍普金斯大学的药物和分子科学系也研发出了含有17，000个蛋白质的生物芯片，但是可以看出其芯片上所含有的蛋白质数远没有达到人体所含有的理论蛋白数。目前，哈佛大学的Josh LaBaer等利用体外无细胞表达系统制成了含有14，000个蛋白质的蛋白质组芯片，但这种基于高密度点样的无细胞表达技术极易造成交叉污染从而可能导致产生信号偏差的错误。显然，通过以上各种方法都不能制备得到真正科学意义上的全蛋白质组芯片。在本专利技术中，我们从细胞或组织中直接分离获得大量天然表达的活性蛋白质，并以此为基础提供生物芯片点样用原料；其优点是整合蛋白质分离、测试和序列分析技术于一体，从而有效解决现有蛋白质芯片制备所遇最大瓶颈，即蛋白样品来源问题。采用本专利技术所述技术，可以快速、高效制备针对于不同物种，包括动植物、微生物各个生物层次及生理层次，包括单一个体、器官、组织、细胞、体液及各种复杂生物材料所对应的特殊蛋白质组芯片。本专利技术还涉及以上所述的个体全蛋白组芯片在蛋白质组研究、抗体特异性检测、蛋白翻译后修饰检测、蛋白与蛋白、蛋白与核酸及小分子相互作用、自身抗原抗体的筛选与检测、药物靶点预测、酶底物谱筛选鉴定、酶活位点鉴定、疾病与生命活动监测、“个性化”医疗等方面的应用。实践已经证明，该方法的确是一种高效快速制备蛋白质组芯片的新策略。
技术实现思路
本专利技术制备个体全蛋白质组芯片的方法包括以下步骤1.样品制备，提取样品的全蛋白质组，将获取的全蛋白质组样品进行高丰度蛋白的去除与低丰度蛋白的富集，获得蛋白质样品混合液；2.使用蛋白质高通量分离技术，使蛋白质样品混合液分别按照一定的物理、化学和/或生物性质分离成多个蛋白质组份；如果需要，在蛋白质通过高通量分离技术后，回收蛋白质样品；3.将分离的多个蛋白质组份根据其来源进行排序，制备出具有可寻址性质的蛋白质组芯片；4.芯片表面的生物反应/实验；5.根据芯片生物反应实验结果对特定蛋白质进行结构解析和功能测定。在一种实施方式中，个体样品可以是器官、组织、体液、或细胞。在样品制备时，可以根据本领域常规技术，对器官、组织、体液、细胞样品进行操作。例如，器官与组织样品进行液氮研磨与裂解液裂解后离心提取上清；细胞直接使用裂解液裂解后离心提取上清；体液如血清与组织液等则直接可用。将获取的全蛋白质组样品进行高丰度蛋白的去除与低丰度蛋白的富集，具体操作时根据实验目的不同可分别选择使用GE公司的去血清/血浆白蛋白/IgG等高丰度蛋白亲和柱、Agilent的多重亲和去除离心小柱、BIO-RAD的六肽柱等等。在高通量蛋白质分离技术中，全蛋白质组分离的技术主要有双向凝胶电泳技术、双向荧光差异凝胶电泳、高效液相色谱技术、二维液相色谱技术或毛细管电泳技术。使用双向凝胶电泳分离全蛋白质组时，首先将提取的全蛋白质组样品溶于上样缓冲液经过水化、除盐、升压、聚焦完成第一向等电聚焦凝胶电泳后取出IPG胶条放入平衡缓冲液中平衡，然后将IPG胶条放入第二向电泳SDS-PAGE的凝胶上层，使用琼脂糖封胶后即进行第二向SDS-PAGE凝胶电泳，电泳结束后使用考马斯亮蓝染液进行染色。使用双向荧光差异凝胶电泳分离全蛋白质组时，首先将获得的全蛋白组样品进行荧光标记，例如Cy3或Cy5标记，然后溶于上样缓冲液，接着进行第一向等电聚焦凝胶电泳，经过水化、除盐、升压、聚焦完成第一向电泳后，取出IPG胶条放入平衡缓冲液中平衡后将IPG胶条放入第二向电泳SDS-PAGE的凝胶上层，使用琼脂糖封胶后进行第二向SDS-PAGE凝胶电泳，电泳结束后无需染色直接放入扫描仪中进行结果观察。使用高效液相色谱分离全蛋白质组时，一般可以选用C18、CS等反相色谱柱进行分离，其中具体分离条件可以是本领域中常规的蛋白质分离系统，例如流动相A可以为95%水5 %乙腈(含有O.1 %三氟乙酸)，流动相B为5 %水95 %乙腈(含有O. 085 %三氟乙酸)，洗脱梯度为(Γ60 %流动相B, 60 min,流速为2 mL/min,使用紫外进行蛋白分离的检测。使用二维液相色谱分离全蛋白质组时，首先全蛋白质组样品脱盐后溶于第一维液相色谱(HPCF)的上样缓冲液中上样并进行色谱聚焦分离，使用pH梯度进行洗脱，常规每隔O.05、. 5 pH收集一份样品，根据实验要求不同，间隔pH可以具体调整，例如每隔O. 3 pH收集一份样品，PH的梯度为2 10、4. (Γ8. 5,3. 5^7. 5、或4. (Γ6. O ;收集的样品直接进行第二维的高效液相色谱的分离，例如使用C18柱进行分离，其中流动相A为O.1 %三氟乙酸的水溶液，流动相B为含有O. 08 %三氟乙酸的乙腈溶液，洗脱梯度为(Γ100 %流动相B，时间为I 60分钟、5 55分钟、10 50分钟、15 45分钟、或20 40分钟，最后变为5 %的流动相B保持I 30分钟，5 20分钟，或10 15分钟，流速均为O. Γ10 mL/min，使用紫外进行蛋白分离的检测。此外，毛细管电泳是另一种可用于蛋白质分析的新型技术，其兼有电泳和色谱技术的双重优本文档来自技高网...

【技术保护点】
制备个体全蛋白质组芯片的方法，其包括以下步骤：(1)?样品制备，提取样品的全蛋白质组，将获取的全蛋白质组样品进行高丰度蛋白的去除与低丰度蛋白的富集，获得蛋白质样品混合液；(2)?使用蛋白质高通量分离技术，使蛋白质样品混合液分别按照一定的物理、化学和/或生物性质分离成多个蛋白质组份；(3)?在蛋白质通过高通量分离技术后，回收每个蛋白质样品；(4)?将分离的多个蛋白质组份根据其来源进行排序，制备出具有可寻址性质的蛋白质组芯片；(5)?芯片表面的生物反应/实验；(6)?根据芯片生物反应实验结果对特定蛋白质进行结构解析和功能测定。

【技术特征摘要】
1.制备个体全蛋白质组芯片的方法，其包括以下步骤 (1)样品制备，提取样品的全蛋白质组，将获取的全蛋白质组样品进行高丰度蛋白的去除与低丰度蛋白的富集，获得蛋白质样品混合液； (2)使用蛋白质高通量分离技术，使蛋白质样品混合液分别按照一定的物理、化学和/或生物性质分离成多个蛋白质组份； (3)在蛋白质通过高通量分离技术后，回收每个蛋白质样品； (4)将分离的多个蛋白质组份根据其来源进行排序，制备出具有可寻址性质的蛋白质组芯片； (5)芯片表面的生物反应/实验； (6)根据芯片生物反应实验结果对特定蛋白质进行结构解析和功能测定。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是器官、组织、体液、或细胞。3.根据权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜宏武，李传宝，荀一萍，刘佳，王丹阳，刘晨，
申请(专利权)人：北京科技大学，
类型：发明
国别省市：