本发明专利技术涉及一种脂蛋白磷脂酶A2的测定试剂及其制备方法。目的是提供的提供的试剂具有准确度高的特点；提供的制备方法具有制作方便的特点。技术方案是：一种脂蛋白磷脂酶A2的测定试剂，包括以下成份：a、脂蛋白磷脂酶A2试剂1；b、脂蛋白磷脂酶A2试剂2；c、液体型脂蛋白磷脂酶A2参考校准品；其制备方法：1）脂蛋白磷脂酶A2试剂1：均匀混合；2）脂蛋白磷脂酶A2试剂2：（1）取悬浮液；（2）混合物反应；（3）得悬浮液；（4）调整浓度；（5）取（3）中的悬浮液加入（4）中；（6）反应；（7）加入乙醇胺；（8）离心处理；3）液体型LP-PLA2参考校准品：按配方量混合，按含量排列或在混合液中加入纯品。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测脂蛋白磷脂酶A2的试剂及试剂的制备方法，特别是采用乳胶增强免疫比浊法检测脂蛋白磷脂酶A2的试剂，可广泛应用在医学及生物化学
技术介绍
脂蛋白憐脂酶A2(lipoprotein-associated phospholipase A2, Lp_PLA2)又被称为血小板活化因子乙酰水解酶(platelet activating factor_AH, PAF-AH),属于磷脂酶家族中PLA2的一种，是丝氨酸依赖的磷脂酶。人血浆Lp-PLA2主要由成熟的巨噬细胞、单核细胞、T淋巴细胞、肥大细胞、肝细胞等分泌生成，并受炎性介质的调节；Lp-PLA2的主要作用是产生二十烷酸类炎性介质、参与磷脂重建及生物膜的稳定平衡、脂蛋白的代谢、细胞信号传递、宿主反应、促进机体坏死组织自体消失等。Lp-PLA2是反映血管炎症的特异性标记物，在低密度脂蛋白的氧化、促进动脉粥样硬化以及冠心病和卒中的形成等方面发挥重要作用。Lp-PLA2水平升高是预测冠心病和卒中风险的一种独立危险因子。其水平的增加被认为是增加患心脏病或脑卒中的机会。目前已经研制出多种Lp-PLA2抑制剂，有试验结果表明服用高剂量的抑制剂患者病灶处Lp-PLA2降低了 80%，服用低剂量的患者Lp-PLA2降低了 52%，提示降低其含量和活性可能会阻断或延缓斑块炎症的进程。从而提供给临床医生预防和治疗心脑血管事件的新靶点，为临床疾病的早期干预、临床应用治疗提供新思路新方向。目前检测Lp-PLA2常用的实验室方法有放射免疫学分析法(RIA)、化学发光免疫分析法(CLIA)、酶联免疫法(ELISA)，放射免疫学分析法(RIA)法检测耗时长(19 22h)，而且有放射性元素的污染，标记物稳定性差，废弃物难以处理而使其受到限制。化学发光免疫分析法(CLIA)是利用化学发光物质经催化剂催化和氧化剂氧化，形成一个激发态的中间体，这种激发态的中间体回到稳定基态时，发出光子，利用发光信号测量仪测量光子数，从而间接测定LP-PLA2的浓度。目前市场上有管式和板式两种试剂盒，但此法存在吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺直接标记抗体的发光效率低，标记物不稳定，这种直接标记法属于瞬间发光型，很难保证测试结果的稳定性和重复性，而且需要特殊的检测仪器。不便于常规实验室开展。而利用生物素-亲和素系统检测LP-PLA2的电化学发光免疫试剂盒，需要配套昂贵的全自动电化学发光检测仪，常规实验室无法开展，而且给患者带来不必要的费用，增加患者负担。酶联免疫法(ELISA)自动化程度不高，且受人为因素影响较大，重复性差，整个反应测定时间也很长(至少需要40分钟)。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服上述
技术介绍
的不足，提供一种脂蛋白磷脂酶A2(Cholyglycine, LP-PLA2)的检测试剂；所提供的试剂应具有准确度高、测定时间短(最多只需要10分钟，甚至更短)、重复性好，操作简单、适用于各种类型的全自动生化分析仪的特点；所提供的试剂制备方法应具有制作方便以及成本不高的特点。本专利技术提供的技术方案是一种脂蛋白磷脂酶A2的测定试剂，包括以下成份a、脂蛋白憐脂酶A2试剂I缓冲液10-400mmoWL pH 值为 5-10电解质 10-400mmol/L 表面活性剂0.01-10g/L 防腐剂2~4mmol/L 稳定剂4-5mmol/L反应加速剂0.01-50g/L其余是纯化水该试剂I的pH值为7. 0-8. 0 ；b、脂蛋白憐脂酶A2试剂2 抗人LP-PLA2抗沐胶乳颗粒0,0001-0,05ml/ml缓冲液50mmol./+LpH值为 6.0-8.5 防腐剂1.5-3 mmo 1/L稳定剂3-5nunol/L其余是纯化水；所述抗人LP-PLA2抗体胶乳颗粒，其中的羧基胶乳微球的粒径为20_500nm ；C、液体型脂蛋白磷脂酶A2参考校准品缓沖植SO-lOOmraol/L pH 值为 7.2-8.0防腐剂2-3moiol/L稳定剂130-173nimol/L 脂蛋白磷脂酶A2 适量其余是纯化水；所述液体型脂蛋白磷脂酶A2参考校准品包括5份形成LP-PLA2系列浓度的参考校准品；5份参考校准品中的LP-PLA2含量由低到高分别为1. 25ng/ml、2. 5ng/ml、5. 0ng/ml、10. 0ng/ml、20. 0ng/ml ;或者，所述液体型脂蛋白磷脂酶A2参考校准品是单点高浓度的LP-PLA2参考校准品。所述缓冲液是磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液、1，4-哌嗪二乙磺酸(PIPES)缓冲液、4-(2-羟乙基)哌嗪-1-1乙烷磺酸(HEPES)缓冲液、三羟甲基甲胺基丙磺酸(TAPS)缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸(MOPS)缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸(M0PS0)缓冲液、2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液中的一种或两种以上任意比例的混合。所述试剂I中的缓冲液浓度20-200mmol/L，pH值7. 0-8. O。所述反应加速剂是聚乙二醇或硫酸葡聚糖(DS-50 )。所述反应加速剂浓度优选O. 05_30g/L。所述稳定剂是乙二胺四乙酸二钠、牛血清白蛋白、氯化钠中的一种或两种以上任意比例的混合。所述电解质是阴离子电解质或阳离子电解质。所述电解质优选阳离子中的氯化钠(NaCl )，浓度为50-200mmol/L。所述表面活性剂是非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂或两性离子表面活性剂。所述非离子表面活性剂是Theist、Tween、聚氧乙烯月桂醚、聚氧乙烯苯基醚、聚氧乙烯辛基苯醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚中的一种或两种以上任意比例的混合。所述表面活性剂浓度优选O. 5-lg/L。所述抗人LP-PLA2抗体胶乳颗粒的浓度为O. 002-0. 01ml/ml。一种脂蛋白磷脂酶A2的测定试剂的制备方法，按照以下步骤进行I)脂蛋白憐脂酶A2试剂1: 按配方量将缓冲液、电解质、表面活性剂、反应加速剂、防腐剂、稳定剂以及纯化水混合均匀，调PH值至7. 0-8. O ；2)脂蛋白憐脂酶A2试剂2 (I)取羧基胶乳微球用缓冲液稀释成浓度为O. Olmg/ml的悬浮液；(2)按Iml的羧基胶乳微球悬浮液加20mgl_乙基_(3_ 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDAC羧基活化剂)和40mg的N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐(NHS)的比例，加入1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐，立即混匀后在室温将此混合物反应15-30分钟，不断搅拌；(3)用缓冲液或纯化水洗涤羧基胶乳微球，除去未反应的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐，并将胶乳微球在纯化水中悬浮得羧基胶乳微球悬浮液，使其浓度为O. Olmg/ml ；(4)将抗人脂蛋白磷脂酶A2抗体溶于缓冲溶液中，使抗人脂蛋白磷脂酶A2抗体的蛋白质浓度为O. 25mg/ml ；(5)取步骤(3)中的羧基胶乳微球悬浮液Iml立即加入步骤(4)中的抗人脂蛋白磷脂酶A2抗体Iml ;使该混合液中羧基胶乳微球、抗人脂蛋白磷脂酶A2抗体和缓冲溶液的浓度分别为 O. 005mg/ml、0. 125本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种脂蛋白磷脂酶A2的测定试剂，包括以下成份：a、脂蛋白磷脂酶A2试剂1其余是纯化水该试剂1的pH值为7.0?8.0；b、脂蛋白磷脂酶A2试剂2其余是纯化水；所述抗人LP?PLA2抗体胶乳颗粒，其中的羧基胶乳微球的粒径为20?500nm；c、液体型脂蛋白磷脂酶A2参考校准品其余是纯化水；所述液体型脂蛋白磷脂酶A2参考校准品包括5份形成LP?PLA2系列浓度的参考校准品；5份参考校准品中的LP?PLA2含量由低到高分别为1.25ng/ml、2.5ng/ml、5.0ng/ml、10.0ng/ml、20.0ng/ml；或者，所述液体型脂蛋白磷脂酶A2参考校准品是单点浓度的LP?PLA2参考校准品。FDA00002616517000011.jpg,FDA00002616517000012.jpg,FDA00002616517000013.jpg
【技术特征摘要】
2012.12.12 CN 201210536452.21.一种脂蛋白磷脂酶A2的测定试剂，包括以下成份a脂蛋白磷脂酶A2试剂I2.根据权利要求1所述的一种测定脂蛋白磷脂酶A2的试剂，其特征在于所述缓冲液是磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液、1，4-哌嗪二乙磺酸(PIPES)缓冲液、4-(2-羟乙基)哌嗪-1-1乙烷磺酸(HEPES)缓冲液、三羟甲基甲胺基丙磺酸(TAPS)缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸(MOPS)缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸(M0PS0)缓冲液、2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液中的一种或两种以上任意比例的混合。3.根据权利要求2所述的一种测定脂蛋白磷脂酶A2的试剂，其特征在于所述试剂I中的缓冲液浓度20-200mmol/L，pH值7. 0-8. O。4.根据权利要求3所述的一种测定脂蛋白磷脂酶A2的试剂，其特征在于所述反应加速剂是聚乙二醇或硫酸葡聚糖。5.根据权利要求4所述的一种测定脂蛋白磷脂酶A2的试剂，其特征在于所述电解质是阴离子电解质或阳离子电解质。6.根据权利要求5所述的一种测定脂蛋白磷脂酶A2的试剂，其特征在于所述表面活性剂是非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂或两性离子表面活性剂；所述非离子表面活性剂是Theist、Tween、聚氧乙烯月桂醚、聚氧乙烯苯基醚、聚氧乙烯辛基苯醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚中的一种或两种以上任意比例的混合。7.根据权利要求6所述的一种测定脂蛋白磷脂酶A2的试剂，其特征在于所述稳定剂是乙二胺四乙酸二钠、牛血清白蛋白、氯化钠中的一种或两种以上任意比例的混合。8.根据权利要求7所述的一种测定脂蛋白磷脂酶A2的试剂，其特征在于所述抗人LP-PLA2抗体胶乳颗粒的浓度为O. 002-0. 01ml/ml。9.权利要求1所述的一种测定脂蛋白磷脂酶A2的试剂的制备方法，按照以下步骤进1)脂蛋白磷脂酶A2试剂1:按配方量将缓冲液、电解质、表面活性剂、反应加速剂、防腐剂、稳定剂以及纯化水混合均匀，调pH值至7. 0-8.0 ；2)脂蛋白磷脂酶A2试剂2:(1)取羧基胶乳微球用缓冲液稀释成浓度为O.01mg/ml的悬浮液；(2)按Iml的羧基胶乳微...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈开华，其他发明人请求不公开姓名，
申请(专利权)人：元升生物科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：
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