人抗表皮生长因子受体抗体制造技术

本发明专利技术涉及人抗表皮生长因子受体抗体。具体地，本发明专利技术提供了全长人抗体，其与人EGFR的结合亲和力高于IMC-C225，并能中和EGFR活性。该抗体包括完整免疫球蛋白、单价Fab和单链抗体、多价单链抗体、双抗体、三抗体和单区域抗体。本发明专利技术还提供编码并表达这些抗体的核酸、宿主细胞和动物。本发明专利技术进一步提供单用或与其它药物联用该抗体中和EGFR活性、治疗哺乳动物肿瘤生长和非癌性过度增生疾病的方法。

【技术实现步骤摘要】
人抗表皮生长因子受体抗体本申请是申请日为2005年3月21日的中国专利申请200580015481.2“人抗表皮生长因子受体抗体”的分案申请。
本专利技术关系到表皮生长因子受体(EGFR)特异的单克隆抗体。这些抗体可以用于治疗含肿瘤性疾病和过度增生性疾病在内的疾病。
技术介绍
正常细胞的增生是通过生长因子酪氨酸激酶(RTKs)被其各自的配体激活所致，该过程是高度受控的。虽然肿瘤细胞的增生也是通过生长因子受体激活达成，但却失去了对正常增生的精确控制。许多因素可以导致这种失控，如生长因子和/或受体的过度表达，生长因子所调节的生物化学通道的自主激活。涉及到肿瘤生成的RTKs的例子有表皮生长因子受体(EGFR)、血小板源性生长因子(PDGFR)、胰岛素样生长因子(IGEF)、神经生长因子(NGEF)和成纤维细胞生长因子(FGF)。这些生长因子与其细胞表面的受体的结合导致受体被激活，从而激活并改变信号传导通路，引起细胞增生和分化。表皮生长因子(EGF)受体家族成员为特别重要的与表皮细胞的肿瘤化有关的生长因子受体酪氨酸激酶。最早发现的EGF受体家族成员为在许多类型的肿瘤细胞上都有表达的EGFR。EGFR被发现涉及到调节肿瘤细胞的分裂、生长、修复、存活、血管生成、浸润和转移。EGFR是一个170kD的跨膜糖蛋白，有一个细胞外配体结合功能域、穿膜区段和一个细胞内蛋白酪氨酸激酶功能域。刺激EGFR的配体包括表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF-α)、肝素结合生长因子(HBGF)、β-cellulin和Cripto-1。配体的特异性结合引起EGFR自主磷酸化，从而活化细胞内酪氨酸激酶功能域并启动调节肿瘤生长和存活的多种信号传导通路。EGFR通路也影响肿瘤内其他血管生成因子，如VEGF和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的产生。激活EGFR的生长因子被认为也在肿瘤血管生长中发挥重要作用。血管生成指从胚胎和成年生物体已有的血管上形成毛细血管，是已知的肿瘤生长、存活和转移的关键因素。有报道称EGFR介导的肿瘤细胞刺激导致血管生成因子，血管内皮生长因子(VEGF)、白介素-8(IL-8)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的表达增强，从而引起肿瘤相关的血管内皮细胞的活化。肿瘤相关的血管内皮细胞的刺激也可通过肿瘤产生的生长因子，如TGF-α和EGF激活自身的EGF受体引起。已有人体肿瘤表达和过量表达EGFR的报道，EGFR的表达与不良预后、低存活率和/或高转移率成相关关系。EGFR，由于涉及到肿瘤形成，已经成为抗肿瘤治疗的特异性靶目标。这些治疗主要包括阻断配体结合到受体细胞外功能域的单克隆抗体或直接作用于细胞内区段以防止信号传导的合成的酪氨酸激酶抑制剂。例如，CetuximabMab()为一种能够与人EGFR细胞外功能域特异性结合的重组人/鼠嵌合的单克隆抗体，Cetuximab是一种阻断配体与EGFR结合、防止受体活化，从而抑制表达EGFR的肿瘤细胞生长的EGFR拮抗剂。西妥昔单抗(Cetuximab)已被批准与依立替康联合或单独用药以治疗表达表皮生长因子受体的、对基于依立替康的化疗无效或不耐受的转移结肠直肠癌患者。西妥昔单抗也已显示出其对银屑病的效果。
技术实现思路
本专利技术提供特异于EGFR、优选特异于包括选自含有SEQIDNO：2、SEQIDNO：4、SEQIDNO：6、SEQIDNO：10、SEQIDNO：12、SEQIDNO：14的一组序列的EGFR细胞外区的从1到6的互补决定区的任何区域的单克隆抗体或其片段。优选抗体为人源性抗体，更优选的是本专利技术中的抗体或其片段含有SEQIDNO：2、SEQIDNO：4、SEQIDNO：6。可选但也是优选的是本专利技术中的抗体或其片段含有SEQIDNO：10、SEQIDNO：12、SEQIDNO：14。更为优选的是本专利技术中的抗体或其片段含有SEQIDNO：8重链可变区和SEQIDNO：16轻链可变区。本专利技术中的这些抗体或其片段具有多种特性，包括中和EGFR及防止EGFR的配体与其受体的结合的能力。此外，本专利技术提供编码本抗体及其片段的分离的多核苷酸，同时也提供含有被操作性地连接到表达序列上的这些多核苷酸序列的表达载体。本专利技术也提供含有表达载体或其子代的重组宿主细胞，该细胞表达本专利技术中的抗体或其片段。本专利技术还提供生产这些抗体或其片段的方法，包括在一定条件下培养细胞以使抗体或其片段得以表达，然后从细胞或细胞培养基中纯化获得抗体或其片段。同时，本专利技术提供在哺乳动物体内治疗肿瘤生长的方法，包括给予哺乳动物有效剂量的本抗体。本抗体也可同与其他PTKs结合的抗体一起给药。本方法也包括给予哺乳动物抗肿瘤药物或抗肿瘤治疗，包括例如某种化疗药物和/或放射治疗。在某些实施方案中，肿瘤生长受到抑制。在优选实施方案中，治疗引起肿瘤消退。本专利技术还提供治疗哺乳动物非癌性增生性疾病，即银屑病的方法，包括给予哺乳动物有效剂量的本抗体。附图说明图1A和图1B：表达免疫球蛋白的克隆载体pDFC和pEE12.1L。图1C：含有全长单链人抗EGFR抗体基因的载体质粒pGS-11F8.图2：pGS-11F8的酶切图谱。DNA大小标记以kb为单位指示在DNA梯上。图3：ELISA法测定IMC-C11F8和IMC-C225与EGFR在体外的结合。图4：IMC-11F8和IMC-C225与125I标记的EGF在体外与EGFR竞争结合的结果。图5：IMC-11F8和IMC-C225对BxPC3细胞内的EGFR磷酸化的效应，所用对照抗体为IMC-1C11。图6：IMC-11F8和IMC-C225抑制A431细胞中EGFR磷酸化。图7：显示抑制A431细胞内EGFR的磷酸化。在未刺激的对照细胞(1道)、EGF(2道)、IMC-C225(3道)、IMC-11F8(4道)和对照抗体(5道)存在下的EGFR的磷酸化的Westernblot分析。图7A：用抗磷酸化酪氨酸抗体显示的磷酸化的EGFR。图7B：被刺激细胞内的总EGFR。图8：各种浓度的IMC-11F8抑制EGF刺激的EGFR磷酸化。图8A显示用抗磷酸化酪氨酸抗体对未刺激对照细胞(1道)、未用IMC-11F8抗体处理的刺激细胞(2道)、15μg/ml(3道)、3μg/ml(4道)和0.6μg/ml(3道)IMC-11F8中的EGFR进行的westernblot分析。图8B显示的是总EGFR。图9：通过MTT试验检测IMC-11F8、IMC-C225和对照抗体对DiFi细胞增生的抑制。图10：用IMC-11F8或IMC-C225(ERBITUXTM)处理的51Cr标记的DiFi细胞的特异性裂解。图11：A431肿瘤细胞在用IMC-11F8或IMC-C225(西妥昔单抗(Cetuximab))治疗的鼠体内的生长。未处理过的鼠用作肿瘤生长的对照。图12：BxPC3肿瘤细胞在用IMC-11F8或IMC-C225(西妥昔单抗(Cetuximab))治疗的鼠体内的生长。未处理过的鼠用作肿瘤生长的对照。图13：用生理盐水或IMC-11F8治疗的异种移植人源肿瘤的裸鼠的免疫组化染色。图A和B：生理盐水或IMC-11F8治疗的A431异种移植的裸鼠；；图C和D：生理盐水或IMC-11F8治疗的BxP本文档来自技高网...

【技术保护点】
治疗有效量的分离的、与人EGFR特异结合的人抗体或其Fab片段在制备用于在哺乳动物中抑制肿瘤生长的药物中的用途，其中，所述的肿瘤选自结肠直肠肿瘤、头颈部肿瘤、胰腺肿瘤、肺肿瘤，其中所述抗体或其Fab片段含有以下的互补决定区：如序列SEQ?ID?NO:2所示的CDRH1，如序列SEQ?ID?NO:4所示的CDRH2，如序列SEQ?ID?NO:6所示的CDRH3，如序列SEQ?ID?NO:10所示的CDRL1，如序列SEQ?ID?NO:12所示的CDRL2和如序列SEQ?ID?NO:14所示的CDRL3。

【技术特征摘要】
2004.03.19 US 60/554555;2004.11.02 US 60/6242641.治疗有效量的分离的、与人EGFR特异结合的人抗体或其Fab片段在制备用于在哺乳动物中抑制肿瘤生长的药物中的用途，其中，所述的肿瘤选自结肠直肠肿瘤、头颈部肿瘤、胰腺肿瘤、肺肿瘤，其中所述抗体或其Fab片段含有以下的互补决定区：如序列SEQIDNO:2所示的CDRH1，如序列S...

【专利技术属性】
技术研发人员：M刘，Z朱，
申请(专利权)人：英克隆有限责任公司，
类型：发明
国别省市：