本发明专利技术公开的抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌复合特异性IgY制剂，其由10～70重量份的牙龈卟啉单胞菌菌体和菌体碎片与30～90重量份的具核梭杆菌菌体和菌体碎片复合成抗原免疫产蛋母鸡而制备。本发明专利技术还公开了该抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌复合特异性IgY制剂的具体制备方法以及含抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌复合特异性IgY制剂的牙膏。本发明专利技术用于治疗与预防牙龈炎及口臭的IgY牙膏对预防和治疗牙龈炎及口臭具有明显的效果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及IgY抗体及其制备方法和该IgY制剂的应用，特别涉及抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌复合特异性IgY制剂及其制备方法，以及用该IgY抗体制备的预防由这两种菌引起的牙龈炎症及其口臭的牙膏。
技术介绍
我国牙銀、牙周疾病发病率占人口的70%以上,牙銀P卜啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)是慢性龈缘炎、慢性牙周炎、侵袭性牙周炎等牙周病的主要可疑致病菌，其菌毛能够与口腔上皮细胞表面的甘油醛-3-磷酸脱氢酶结合，侵入牙龈上皮细胞和牙龈成纤维细胞，逃避免疫清除。牙龈卟啉单胞菌产生二肽酰氨肽酶降解结缔组织，促进MMP-2和MMP-1活性增加。牙龈卟啉单胞菌的精氨酸和赖氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(RgpA、RgpB,·Kgp)能水解L-12导致INNy产生减少。部分牙龈卟啉单细胞毛能够诱导巨噬细胞表达L-1a、L-1 β、L_6、TNF a导致牙槽骨破坏。在牙周病患者同时伴随着口臭的发生，其口臭主要有具核梭杆菌引起。目前没有有效的治疗口臭的方法，使用抗菌素类药物治疗口臭有很多弊端。对于预防和治疗牙周病及其口臭从主要的病因菌牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌中着手是关键所在。目前用于预防和治疗牙周炎的牙膏一般为含有中草药成分的牙膏。虽然这类的专利有很多，但均无明确疗效。现有文献报道表明临床上使用特异性IgY抗体预防龋齿和治疗婴幼儿轮状病毒性腹泻，预防肺纤维化患者绿脓杆菌感染，减轻幽门螺杆菌引起的胃痛效果显著，且无副作用和成瘾性。在我们研究的许多种类的IgY中发现，有的牙周病因菌免疫母鸡产生的IgY抗体经实验证明没有或没有明显的抑制牙周病及其口臭的趋势和疗效。简单的说，不是所有的IgY都有明显的治疗作用。由于牙周病及其口臭的可疑病因菌有十一种之多，但主要的可疑病因菌包括牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、伴放线菌放线杆菌、栖牙密螺旋体、福氏拟杆菌、牙龈二氧化碳噬纤维菌等。在探索制备对应的IgY用于治疗牙周病及其口臭的同时，我们推测牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、伴放线菌放线杆菌、栖牙密螺旋体、福氏拟杆菌、牙龈二氧化碳噬纤维菌都有可能引起牙周病及其口臭；因为我们事先无法预测在这当中的哪些菌是引起牙周病及其口臭的主要因素，哪些菌是引起牙周病及其口臭是次要因素。我们认为必须有合适的抗牙周病及其口臭的试验来确定哪些菌是引起牙周病及其口臭的主要因素。从而指导制备抗牙周病及其口臭的药物或卫生产品。目前的现有技术没有相关的提示指导技术人员发现抗牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌复合IgY是解决治疗牙周病及其口臭的关键。技术人员无法预先在不做抗牙周病及其口臭的实验的前提下，预先得知牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌是引起牙周病及其口臭的主要因素。技术人员无法预先在不做抗牙周病及其口臭的实验的前提下，预先得知抗牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌复合IgY比单独的抗牙龈卟啉单胞菌IgY、单独的抗具核梭杆菌IgY的效果更好。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题之一在于提供抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌复合特异性IgY制剂。本专利技术所要解决的技术问题之二在于提供上述抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌复合特异性IgY制剂的制备方法。 本专利技术所要解决的技术问题之三在于提供含上述抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆 菌复合特异性IgY制剂的用于预防由这两种菌引起的牙周炎症及其口臭的牙膏。作为本专利技术第一方面的抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌复合特异性IgY制剂，其特征在于，由10 70重量份的牙龈卟啉单胞菌菌体和菌体碎片与30 90重量份的具核梭杆菌菌体和菌体碎片复合成抗原免疫产蛋母鸡而制备。作为本专利技术第二方面的抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌复合特异性IgY制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤A.牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌培养步骤A.1细菌种类牙銀P卜啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)和具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)；A. 2取牙龈卟啉单胞菌(P. g)ATCC33277菌株和具核梭杆菌(Fn)ATCC10953菌株，分别经BH1-S培养基分离培养和扩增培养的牙龈卟啉单细胞菌、具核梭杆菌，并经鉴定确认为牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌而得到牙龈卟啉单胞菌菌体和菌体碎片、具核梭杆菌菌体和菌体碎片；B.免疫原制备步骤B.1取牙龈卟啉单胞菌菌体和菌体碎片10 70重量份，具核梭杆菌菌体和菌体碎片30 90重量份复合成菌液抗原；B. 2将等体积的菌液抗原与等体积的福氏完全佐剂复合，使用高速搅拌器搅拌乳化，最终制成油包水福氏完全佐剂牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌复合免疫原；每毫升福氏完全佐剂复合免疫原含有细菌10亿-80亿；B. 3将等体积的复合菌液与等体积的福氏不完全佐剂复合，使用高速搅拌器搅拌乳化，最终制成油包水福氏不完全佐剂牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌复合免疫原，每毫升福氏不完全佐剂复合免疫原中含有细菌10亿-80亿；C.免疫步骤使用注射器将福氏完全佐剂复合免疫原皮下和肌肉注射给产蛋母鸡，每只产蛋母鸡注射O. 5ml-3. Oml免疫原，然后每隔一周使用福氏不完全佐剂复合免疫原O. 5ml_3. Oml皮下和肌肉注射给产蛋母鸡。加强免疫二次后，此后每隔十周再使用福氏不完全佐剂复合免疫原O. 5ml-3. Oml皮下和肌肉注射给产蛋母鸡加强免疫五次，前后共免疫八次；D.抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌复合特异性IgY提取物的制备收集免疫第一次免疫后第28天的免疫母鸡鸡蛋，使用75%的酒精进行鸡蛋表面消毒，打开蛋壳取蛋黄，去除蛋黄膜取蛋黄液，将蛋黄液与蒸馏水按体积比1:10的比例加蒸馏水，充分搅拌，并使用冰醋酸调节酸碱度至PH5. 30-5. 50,然后放置-20°c冻藏3天后取出解冻，取上清液，用凝胶过滤系统将蛋黄液浓缩20倍，用IN NaOH调节PH至7. 0-8. 0，置-20°C保藏。上述抗牙銀卟啉单胞菌和具核梭杆菌复合特异性IgY制剂的制备方法，在所述步骤D后增加一 IgY纯化步骤，具体是将抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌复合特异性IgY提取物加硫酸胺至55%的饱和度，充分搅拌，室温静置2小时，然后高速离心10分钟，取沉淀，将沉淀使用蒸馏水稀释到原体积量，再加硫酸胺至33%的饱和度，充分搅拌，室温静置2小时，然后高速离心10分钟，取沉淀，用蒸馏水稀释溶解后装入透析袋，用蒸馏水经中空纤维 过滤器除盐，即得抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌复合特异性IgY制剂纯品。在本专利技术一个优选实施例中，所述步骤D用以下方法所取代收集免疫第一次免疫后第28天的免疫母鸡鸡蛋，用75%酒精消毒鸡蛋外壳，打碎蛋壳，留取蛋黄。用去离子水10倍稀释蛋黄后，用冰醋酸和无水乙酸钠调节PH至5. 30-5. 50.，4°C沉降后取上清液，添加2%的壳聚糖和海藻酸钠，2%氯化钙和多聚磷酸钠絮凝沉降，再取上清液用凝胶过滤系统超滤去除多余的去离子水，将蛋黄液浓缩20倍左右，用IN氢氧化钠调节PH至7. 0-8. 0，置-20°C保藏。作为本专利技术第三方面的用上述抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌复合特异性IgY制剂制备的用于预防牙龈炎及其口臭的牙膏，包含有抗牙周致病菌IgY制剂，所述抗牙周致病菌IgY制剂由占牙膏总质量的质量百分比原料组成抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌复合特异性IgY制剂O.本文档来自技高网...
【技术保护点】
抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌复合特异性IgY制剂，其特征在于，由10～70重量份的牙龈卟啉单胞菌菌体和菌体碎片与30～90重量份的具核梭杆菌菌体和菌体碎片复合成抗原免疫产蛋母鸡而制备。
【技术特征摘要】
1.抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌复合特异性IgY制剂，其特征在于，由10 70重量份的牙龈卟啉单胞菌菌体和菌体碎片与30 90重量份的具核梭杆菌菌体和菌体碎片复合成抗原免疫广蛋母鸡而制备。2.权利要求1所述的抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌复合特异性IgY制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤 A.牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌培养步骤 A.1细菌种类牙銀B卜啉单胞菌(Porphyromonas gingival is)和具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)； A.2取牙龈卟啉单胞菌(P. g)ATCC33277菌株和具核梭杆菌(Fn)ATCC10953菌株，分别经BH1-S培养基分离培养和扩增培养的牙龈卟啉单细胞菌、具核梭杆菌，并经鉴定确认为牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌而得到牙龈卟啉单胞菌菌体和菌体碎片、具核梭杆菌菌体和菌体碎片； B.免疫原制备步骤 B.1取牙龈卟啉单胞菌菌体和菌体碎片10 70重量份，具核梭杆菌菌体和菌体碎片30 90重量份复合成菌液抗原； B. 2将等体积的菌液抗原与等体积的福氏完全佐剂复合，使用高速搅拌器搅拌乳化，最终制成油包水福氏完全佐剂牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌复合免疫原；每毫升福氏完全佐剂复合免疫原含有细菌10亿-80亿； B.3将等体积的复合菌液与等体积的福氏不完全佐剂复合，使用高速搅拌器搅拌乳化，最终制成油包水福氏不完全佐剂牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌复合免疫原，每毫升福氏不完全佐剂复合免疫原中含有细菌10亿-80亿； C.免疫步骤 使用注射器将福氏完全佐剂复合免疫原皮下和肌肉注射给产蛋母鸡，每只产蛋母鸡注射O. 5ml-3. Oml免疫原，然后每隔一周使用福氏不完全佐剂复合免疫原O. 5ml_3. Oml皮下和肌肉注射给产蛋母鸡。加强免疫二次后，此后每隔十周再使用福氏不完全佐剂复合免疫原O. 5ml-3. Oml皮下和肌肉注射给产蛋母鸡加强免疫五次，前后共免疫八次； D.抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌复合特异性IgY提取物的制备 收集免疫第一次免疫后第28天的免疫母鸡鸡蛋，使用75%的酒精进行鸡蛋表面消毒，打开蛋壳取蛋黄，去除蛋黄膜取蛋黄液，将蛋黄液与蒸馏水按体积比1:10的比例加蒸馏水，充分搅拌，并使用冰醋酸调节酸碱度至PH5. 30-5. 50，然后放置-20°C冻藏3天后取出解冻...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈健芬，罗鑫龙，孙晓青，张萍，
申请(专利权)人：上海美加净日化有限公司，
类型：发明
国别省市：
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