本发明专利技术提供了一株廉价高效的微生物酶产生菌——蜡状芽孢杆菌（Bacillus?cereus）WZZ001，并提供了以外消旋α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸酯为反应底物，以该菌产生的酯水解酶催化立体选择性水解(R)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸酯从而制备(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸酯的方法。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2012年10月14日，保藏编号：CCTCC?No：M2012403。本发明专利技术的有益效果主要体现在：本发明专利技术菌株产生的酯水解酶的区域选择性强，反应转化率高，下游分离简单，能耗低，环境污染小，适合工业化生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)WZZ001及其在微生物催化制备左乙拉西坦中间体一式(II )所示的(S)-C1-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸酯中的应用，以及一种微生物催化制备式(II)所示的(S)-C1-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸酯的方法，该中间体可通过胺解反应合成左乙拉西坦。
技术介绍
左乙拉西坦(levetiracetam, LEV,商品名Keppra)化学名称为(S) - a -乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酰胺，为吡拉西坦衍生物，是一种新型抗癫痫药物(AED)。1999年经 美国FDA批准，最初用于成人部分性癫痫发作.2005年6月其口服片剂和溶液剂被批准用于4岁以上(包括4岁)儿童部分性发作的辅助治疗。2007年3月10日在中国上市(商品名开浦兰)。左乙拉西坦具有不同于其他抗癫痫药物的独特作用机制，它是迄今惟一证实与突触前神经末梢内突触小泡蛋白SV2A结合的抗癫痫药物，也是目前报道的唯一具有预防癫痫发生作用的抗癫痫药物。研究表明，在一定治疗剂量范围内左乙拉西坦及其主要代谢物，既不是人体肝脏细胞色素P450、环氧化水解酶或尿苷二磷酸-葡萄苷酶的抑制剂，也不是它们具有高亲合力的底物，因此，不易出现药代动力学相互作用。对于成人难治性部分性发作，左乙拉西坦是治疗癫痫部分性发作的首选加用药物；对于儿童部分性癫痫发作，亦有良好的显著效果，且副作用轻微，对临床治疗极具参考价值。该药物起效迅速，表现出良好的抗癫痫疗效和耐受性、安全性，除用于难治性癫痫的辅助治疗之外，其适应症也逐渐扩展到新诊断癫痫的单药治疗。目前，文献报道的合成左旋乙拉西坦的方法主要是化学拆分法和利用手性氨基酸作为起始底物的合成方法。前者，以吡咯烷酮为原料，过程中与外消旋体(±)-2_溴丁酸甲酯反应，又与(R) - a -甲基苄胺成盐，再经氨解等反应得到左旋对映体；后者，主要以甲硫氨酸为原料，通过酯化、酰胺化、闭环和脱硫等多步反应得到左旋产物。这些传统工艺途径存在着收率低、成本高、步骤繁多、产物纯度较低、污染严重等问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决上述方法的不足，通过筛选产脂肪酶微生物，提供了一株廉价高效的微生物酶产生菌，并提供了以外消旋a -乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸酯为反应底物，以该菌产生的酯水解酶催化立体选择性水解(R)-Q-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸酯从而制备(S)-a -乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸酯的的方法。本专利技术采用的技术方案是蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus) WZZ001，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏日期2012年10月14日，保藏编号=CCTCCNo M 2012403。该菌株通过以下程序筛选分离得到(I)称取湿土样I g混悬于10 mL无菌生理盐水中，振荡混勻；接3 mL混悬液于50 mL液体富集培养基中，在30 0C >200 r/min下培养4 5 d后，无菌操作转接I mL浑浊的菌液到新鲜的液体富集培养基，连续富集:T4次。富集培养基中，以外消旋a-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯为唯一碳源，配方如下NaNO3 3.0 g/L, KH2PO4 1.0 g/L，MgSO4*7H20 0. 5 g/L, KCl 0. 5 g/L, FeSO4*7H20 0. 01 g/L, (±) -a -乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯10 mmol/L，pH 7. O。(2)将富集后菌液经梯度稀释，涂布分离平板培养基，多次分离，获取单菌落。分离平板培养基组成为富集培养基加入琼脂23 g/L, pH 7.0。(3)挑取分离得到的单菌落先后接种于50 mL的斜面培养基和种子培养基，30 °C、200 r/min培养24 h，得到种子液；在无菌条件下，取3 mL种子液接种于50 mL的产酶培养基中，30 °C,200 r/min培养24 h，得到发酵液。斜面培养基组成与分离平板培养基一致； 种子培养基配方为蛋白胨5 g/L,牛肉膏5 g/L,酵母膏I g/L,葡萄糖5 g/L, MgSO4 5 g/LjK2HPO4 1.5 g/L,KH2PO4 0.5 g/L，溶剂为水，pH 7. 0 ;产酶培养基组成为:蛋白胨10 g/L,葡萄糖 5 g/L, MgSO4 5 g/L, K2HPO41. 5 g/L, KH2PO4 0. 5 g/L，橄榄油 5 g/L，溶剂为水，pH7. O。(4)取10 mL发酵液于10 mL离心管中6000 rpm离心15 min,弃上清液,加入2 mL 0. 2 mo I/L pH 7. 2的磷酸盐缓冲液，振荡混匀，再加入5. 66 g/L底物(±)-a-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯。在30。。、200 r/min下，转化24h。取出离心管，加入2 mL乙酸乙酯,充分振荡,6000 rpm离心15 min。取上层有机相I mL,用少量无水硫酸钠干燥除水，以气相色谱检测(S)-a-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯的对映体过量值(e. e.)，并用旋光仪检测不对称水解产物的比旋光度，筛选得到所述微生物菌株一WZZ001菌。菌落形态特征30 1下，培养32h，菌落呈圆形，边缘呈裂叶状，中心凸起，乳白色，干燥，无光泽。细胞形态特征细胞为直或弯曲的短杆状，大小为,单个分散排列。生理生化特征WZZ001菌为革兰氏阳性菌，专性好氧，生长对pH变化不敏感。利用无机氮源的能力较差。生长和产酶受到Cu2+、Mn2+的抑制，受到Mg2+、Fe3+、Ca2+等的促进。经测序鉴定，WZZ001菌的 16S rDNA 序列如下GTGCTATACATGCAAGTCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACTGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAA本文档来自技高网...
【技术保护点】
蜡状芽孢杆菌（Bacillus?cereus）WZZ001，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072，保藏日期：2012年10月14日，保藏编号：CCTCC??No：M??2012403。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：汪钊，郑建永，鄢洪德，章银军，宣磊，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：
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