本发明专利技术涉及微生物工程技术领域，具体提供了一种植酸酶，并构建了重组表达该植酸酶的黑曲霉工程菌株，保藏编号为CCTCC?NO:?M?2012502。该工程菌株能高效表达植酸酶，摇瓶发酵酶活为280U/mL。本发明专利技术重组表达的植酸酶可广泛应用于饲料领域，提高养殖动物对磷的吸收能力，增加养殖效益，同时减少磷的排放，有利于环境保护。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物工程
，具体涉及一种植酸酶及其重组表达工程菌株。
技术介绍
植酸酶(Phytase)即肌醇六憐酸水解酶(Myo-i-nositolhexaphosphatephosphohydrotase),是催化植酸以及植酸盐水解成肌醇与磷酸(或磷酸盐)的一类酶的总称(黄遵锡，1999，食品与发酵工业)。植酸酶是一种糖蛋白，在植物、反刍动物、许多微生物包括酵母、霉菌、细菌中都能产生植酸酶。它能够解除动物植物性饲料中植酸的抗营养作用，提高植物性饲料的营养价值。植酸酶作为一种新型饲料添加剂，在动物生产以及在环境保护中，都有重要的应用价值。然而植酸酶在天然材料中表达水平较低，加之天然植酸酶的某些生物学特性(如热 稳定性，抗蛋白酶特性等)不能完全适合饲料加工的要求。随着生物技术的飞速发展，采用基因工程的手段，使酶的高产优质成为可能，成为酸酶研究的热点。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种植酸酶及其重组表达工程菌，通过构建含有植酸酶基因的表达载体，转入黑曲霉(Aspergillus niger)中，获得高效表达该植酸酶的黑曲霉工程菌株。本专利技术重组表达的植酸酶可广泛应用于饲料领域，能有效提高养殖动物的生产性能和对磷的吸收能力，从而减少磷的排放量，增加养殖效益。本专利技术的植酸酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO: I。用于编码上述植酸酶的核苷酸序列为SEQ ID N0:2。本专利技术涉及一种黑曲霉工程菌，为黑曲霉LH-KAspergillus niger LH-1)，该工程菌携带有能表达黑曲霉植酸酶基因的表达载体，已于2012年12月5日，保藏于位于武汉市武昌珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO: M 2012502。本专利技术另一方面涉及上述黑曲霉工程菌的应用，用于生产植酸酶。本专利技术另一方面涉及上述植酸酶在饲料中的应用。本专利技术构建的黑曲霉工程菌能高效表达植酸酶，摇瓶发酵酶活为280U/mL。本专利技术重组表达的植酸酶能有效提高肉鸡生产性能。在日粮中添加本专利技术重组表达的植酸酶，肉鸡各期平均日增重、料肉比都优于对照组，并且优于国外某植酸酶产品。本专利技术的植酸酶能提高肉鸡对磷的吸收能力，使磷的排泄量降低10. 7%以上，从而有利于增加养殖效益。附图说明图I :pVL_phy 质粒图谱。图2 :黑曲霉工程菌发酵上清液SDS-PAGE电泳分析图，其中箭头所指处即为重组表达的植酸酶。具体实施例方式以下实施例是为了更好地说明阐述本
技术实现思路
，本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本专利技术。但是，本专利技术的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。实施例I黑曲霉植酸酶基因的克隆I. I提取黑曲霉的总基因组DNA将黑曲霉过夜培养，取适量菌体置于离心管中，13000 rpm离心5 min，弃上清；力口A 400 u I 抽提缓冲液(100 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, 250 mM NaCl, 1%SDS);然后加IOOmg石英砂或玻璃珠，在珠打仪剧烈振荡2min左右；65°C水浴20min后，加入200 u LlOMNH 4AC,冰浴IOmin ;13000rpm离心IOmin,取上清；加入2倍体积的无水乙醇，-20°C放置30min ；13000 rpm离心IOmin,弃上清；用70%乙醇洗漆2次；晾干,加入水溶解,于_20°C保存。I. 2基因克隆以I. I中提取的基因组总DNA为模板，利用如下的引物对进行扩增，引物对的上下游引物序列如下上游引物序列为GCTCTAGAATGGGCGTCTCTGCTGTTCTA；下游引物为GCTCTAGACTAAGCAAAACACTCCGCCCAATCA；PCR 扩增条件为 95°C 4min ；94°C 30S ；55°C 40S，72°C Imin 30 个循环；72°C7min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。经北京华大基因研究中心测序分析，扩增产物的核苷酸序列为SEQ ID N0:3, SEQ ID NO:3第45-146位是内含子，去掉该内含子的cDNA序列为SEQ ID NO:2，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO: I。实施例2黑曲霉工程菌的构建2. I表达载体构建对I. 2中得到的PCR产物先进行Xba I单酶切。同样，对黑曲霉表达质粒pGAMD也进行Xba I单酶切。利用PCR纯化试剂盒回收酶切产物。用T4连接酶把酶切产物即克隆基因和表达载体22°C连接过夜。最后，把连接产物导入大肠杆菌DH5 a ;然后通过PCR验证连接正确与否，最后将相应的阳性克隆表达质粒命名为pVL-pPhy，质粒图谱见图I。2.2原生质体制备接种黑曲霉菌丝于PDA平板上生长4天；切取直径约3cm的菌落置于约IOOmLCMA (2%麦芽提取物、2%葡萄糖，0. 1%细菌蛋白胨)的液体培养基中，30°C，200 rpm振荡培养过夜；多层纱布过滤收集菌丝；将菌丝置于盛有20 mL裂解酶液(Sigma L1412)酶解2_3小时；取出酶解液，加入0. 8M MgSO4溶液，轻轻摇晃，倒于三层灭菌擦镜纸过滤，收集滤液，3000 rpm,离心10 min;弃上清，加10 mL I. 2M山梨醇悬浮，然后3000 rpm,离心10 min ；加适量山梨醇悬浮分装(200 ML/管，IO8个/mL)。2. 3转化与验证取10吒Phy-pGAMD DNA加入到200ML原生质体中，接着加入50ML 25%PEG轻轻混匀，室温静置20 min ;然后加2mL 25%PEG，轻轻混匀，室温静置5min，把原生质体加到50 mL左右熔化后冷却至45-55°C的上层半固体培养基(0. 059%乙酰胺，0. 152%KH2P04，0. 34%CsCl，0. 052%KC1,1%葡萄糖，21. 85%山梨醇，0. 35%琼脂糖)，轻轻混匀后倒入下层基础培养基平板(0. 059% 乙酰胺，0. 152%KH2P04,0. 34%CsC1,0. 052%KC1,1% 葡萄糖，1% 琼脂粉)，30°C黑暗培养数天至转化子长出。按照实施例I中的方法提取转化子基因组DNA为模板，利用引物扩增目的验证转化子。利用实施例I中引物进行PCR扩增目的基因。PCR扩增条件为95°C 4min ；94°C 30S ；55°C 40S，72°C Imin 30个循环；72°C 7min。利用琼脂糖凝胶电泳进行检测分析，验证阳性转化子。所获得工程菌命名为黑曲霉LH-KAspergillus niger LH-I)，于2012年12月5日，保藏于“中国典型培养物保藏中心”，保藏号为CCTCC NO: M 2012502。实施例3发酵与酶活测定3. I摇瓶表达将黑曲霉工程菌(CCTCC NO: M 2012502)接种于50mL黑曲霉发酵培养基(1.2%NaN03，0. 05% KCl, 0. 15% KH2PO4,0. 205% MgSO4 7H20，0. 35% NaH2PO4 H20，7% 柠檬酸钠，4. 5%胰蛋白大豆肉汤，微量元素lmL，4. 1%葡萄糖)，30 0C培养4_5天，离心取上清，进行SDS-PAGE检测分析，结果如图2所示，箭头所指处即为重组表达的植酸酶，重组蛋白本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种植酸酶，其氨基酸序列为SEQ?ID?NO:1。
【技术特征摘要】
1.一种植酸酶，其氨基酸序列为SEQ ID N0:lo2.用于编码权利要求I所述的植酸酶的核苷酸，其序列为SEQID N0:2。3.用于表达权利要求I所述植酸酶的...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄亦钧，许丽红，张慧丹，张青，徐娟，
申请(专利权)人：青岛蔚蓝生物集团有限公司，
类型：发明
国别省市：
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