亚甲蓝光化学灭活HCV病原体效果的检测方法技术

本发明专利技术提供了一种用于检测评价亚甲蓝光化学法病毒灭活效果的方法，以包膜RNA技术构建的HCV假病毒颗粒为质控品，在相同条件下对质控品和需要进行病毒灭活的血液或血液制品在相同条件下进行亚甲蓝光化学病毒灭活。该方法对人体没有病毒感染风险，可通过假病毒颗粒核酸的损伤程度反映HCV感染性的消失情况。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种病毒灭活检测方法，尤其涉及一种PCR技术检测评价亚甲蓝光化学法HCV病毒灭活效果的方法。
技术介绍
输血是临床上治疗和抢救病人常用的医疗措施。近年来，随着医疗技术的不断进步，血液及血液制品的安全性越来越受到人们的重视。输血安全不仅是输血医学和临床治疗学追求的期望目标，也是采供血机构和医疗机构乃至社会各界共同关注的热点和极端敏感的永恒课题。目前，已知有多种病毒可经血液传播，如HIV1/2、HTLVI/II、肝炎病毒HBV和HCV、HDV和HEV、HAV、非甲~戊肝炎病毒（HGV、TTV、SENV）、CMV和EBV、小病毒B19和新克雅氏病毒等等，都有可能引起输血后病毒性传染病，其中尤其以脂质包膜病毒如乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）和艾滋病毒（HIV）危害最大。目前认为提高血液安全性的措施主要是（1）合理的选择献血员、（2）严格的病毒筛选、（3）有效的病毒灭活技术。尽管目前血液检查水平在不断的提高，但是由于检查“窗口期”的存在、以及病毒变异导致免疫反应性的改变、免疫静默感染、新型病毒和亚型变异株的出现等仍使输血时刻存在着风险。采用有效的血液病毒灭活技术是保证输血安全的重要措施之一，也是从根本上解决输血传播病毒风险的有效方法，多年来国外传统病毒灭活方法为巴斯德液体湿热灭活法、有机溶剂/洗涤剂法、干热法、膜过滤法、低pH值孵放法等等，巴斯德液体湿热灭活法主要用于人血白蛋白制品，有机溶剂/洗涤剂法可用于混合血浆，干热法用于冻干制品，膜过滤法只有滤膜孔径比病毒有效直径更小时才能有效去除病毒，而且不能单独使用。上述方法处理难度大、费用高，不能广泛应用于临床用单袋血浆（如100 ml、200 ml）的病毒灭活。由于目前全国各地血站供临床使用的血浆均为单人份血浆，其可能内含的脂质包膜病毒，对人体健康有潜在危害，为了克服此危害，必须对脂质包膜病毒灭活，大量实验数据证明，用亚甲兰光化学处理血浆可完全灭活血浆内所含的VSV和Sindbis病毒（这两种病毒是国内外公认的血液制品病毒灭活有效性的指示病毒，其中VSV是HIV的模型病毒，Sindbis是HCV的模型病毒，均为RNA脂质包膜病毒）。光化学法主要是依靠光敏剂在光照下产生的单线态氧或自由基氧化损伤病毒的分子结构，从而杀灭病毒，各种光敏剂的作用特点不尽相同，如补骨脂内酯衍生物主要产生自由基（一类机制），酞菁类光敏剂主要产生单线态氧（二类机制），而酚噻嗪类光敏剂可能同时涉及两类机制，例如单线态氧和光敏剂介导的自由基可能都参与了亚甲兰（MB）光化学处理对病毒的灭活。亚甲蓝（Methylene Blue Photochemistry，MB）光化学灭活血浆病毒是一种最安全、有效的适合于临床用单袋血浆病毒灭活的方法，被认为是非常有发展前景的临床应用单人份血浆病毒灭活方法，早在1966年Pohl和Mohl发表了使用亚甲蓝和光照灭活病毒血浆的临床经验，自1993年起已在德国、瑞士等多个欧洲国家红十字会输血中心使用，并收到良好的临床效果，2001年亚甲蓝灭活病毒方法在上海血液中心研制成功之后，国内大部分血液中心和中心血站已开展此项目。由于病毒灭活技术受到多种因素的影响，因此建立有效的病毒灭活验证方法、直接而客观的评价病毒灭活的有效性是病毒灭活工作的重要组成部分，也是确保灭活效果达到预期要求、保障血液和血液制品安全性的关键环节。目前多采用体外培养的细胞病变法或动物模型法来判断病毒灭活效果，体外培养方法对实验条件有着严格的要求，对细胞培养、病毒保存有着严格规范，操作繁琐、实验周期长，不利于在基层单位开展，并且因其基于在体外观察病毒靶细胞病变的原理而难以评价其靶细胞无法在体外培养的病毒（如肝炎病毒）的灭活效果；虽然动物模型方法从生物整体水平评价病毒感染性方面具有优势，但是价格昂贵、实验周期长，只适用于研究开发阶段实验，而且对多数人类致病病毒缺乏敏感的模型动物较少，不适合在常规工作中开展，因此建立更简便易行、更经济、更有效的评价指标已成为病毒灭活工作急需解决的问题。核酸检测技术是以检测样本内病毒核酸的有无或含量多少进行病原学诊断的一种方法，是继形态学、生物化学和免疫学诊断之后的第四代诊断检测技术，灵敏度高、特异性强，能够采用定量检测的方法进行质量监控，具有准确性高、检测成本低、耗时少的优点，已被用作病毒感染的常规诊断方法，其中PCR检测是众多核酸检测技术中的经典方法，因其简便快速的特点，很容易被基层检验单位及血站所接受。在病毒灭活有效性评价工作中，病毒灭活质控品的建立是至关重要的。
技术实现思路
本专利技术提供了一种检测评价亚甲蓝光化学法灭活HCV病原体效果的方法，以HCV病毒样颗粒为质控品，利用PCR技术，检测亚甲蓝光化学灭活处理效果，从分子水平对亚甲蓝光化学病毒灭活效果进行质量评价。本专利技术亚甲蓝光化学法灭活HCV病原体效果的检测方法，步骤如下：步骤1，RNA包膜技术构建的含HCV病毒RNA的HCV病毒样颗粒（或称为HCV假病毒颗粒）作为质控品，所述HCV病毒样颗粒由含有MS2噬菌体的成熟酶蛋白、包膜蛋白的基因编码序列、部分调节元件序列以及HCV病毒RNA 5’非编码序列的重组载体原核表达而成；步骤2，将所述HCV病毒样颗粒浓度稀释，与HCV血浆同时进行亚甲蓝光化学处理，并平行检测其核酸变化；步骤3，判病毒灭活效果，质控品灭活效果即为HCV病毒灭活效果。其中，所述核酸变化检测方法为荧光定量PCR检测。其中，所述浓度稀释为HCV病毒样颗粒用代血浆稀释100倍。其中，所述代血浆为羟乙基淀粉注射液。本专利技术将PCR检测技术应用于血液和血液制品病毒灭活有效性的检测中，操作简单，准确度好，实验周期短，更为经济有效，可用于亚甲蓝光化学法HCV病毒灭活效果质量的检测评价。由于常规采供血工作对环境有严格要求，质控品材料必须保证对操作人员和受血者物感染性，对人体不致病，因此，本专利技术以假病毒颗粒为质控品，可避免质控品对人的感染。附图说明图1为HCV病毒核酸量经亚甲蓝光化学处理前后的结果；图2为亚甲蓝光化学处理前后病毒核酸的扩增抑制率；图3为HCV病毒样颗粒以及HCV血浆核酸下降量线性关系；图4 为HCV病毒样颗粒重组表达质粒的结构。具体实施方式本专利技术提供了一种亚甲蓝光化学法HCV病毒灭活效果的检测方法，以利用包膜RNA技术构建的假病毒颗粒为质控品，在相同条件下对血液和质控品进行亚甲蓝光化学灭活，PCR检测灭活前后质控品病毒核酸量的变化，判病毒灭活效果，质控品灭活效果即为HCV病毒灭活效果。HCV病毒样颗粒重组表达质粒的结构如图4所示。下面通过具体实施例对本专利技术检测方法进行进一步详细描述和介绍，以使更好的理解本专利技术，但是下述实施例并不限制本专利技术范围。1．包膜RNA表达质粒的构建设计引物扩增pMS27质粒（购于BCCM）中MS2 1.7kb目的片段（82~1742片段），从BamH I和，Hind III位点插入pET28a质粒，构本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种亚甲蓝光化学灭活HCV病原体效果的检测方法，其特征在于，所述检测方法步骤如下：步骤1，RNA包膜技术构建的含HCV病毒RNA的HCV病毒样颗粒作为质控品，所述HCV病毒样颗粒由含有MS2噬菌体的成熟酶蛋白、包膜蛋白的基因编码序列、部分调节元件序列以及HCV病毒RNA？5’非编码序列的重组载体原核表达而成；步骤2，将所述HCV病毒样颗粒浓度稀释，与HCV血浆同时进行亚甲蓝光化学处理，并平行检测其核酸变化；步骤3，判病毒灭活效果，质控品灭活效果即为HCV病毒灭活效果。

【技术特征摘要】
1.一种亚甲蓝光化学灭活HCV病原体效果的检测方法，其特征在于，所述检测方法步骤如下：
步骤1，RNA包膜技术构建的含HCV病毒RNA的HCV病毒样颗粒作为质控品，所述HCV病毒样颗粒由含有MS2噬菌体的成熟酶蛋白、包膜蛋白的基因编码序列、部分调节元件序列以及HCV病毒RNA 5’非编码序列的重组载体原核表达而成；
步骤2，将所述HCV病毒样颗粒浓度稀释，与HCV血浆同时进行亚甲蓝光...

【专利技术属性】
技术研发人员：张博，郑岚，王迅，黄宇闻，莫琴，钱开诚，
申请(专利权)人：上海市血液中心，
类型：发明
国别省市：