本发明专利技术公开了一种利用双荧光素酶报告基因筛选血管生成相关microRNA的方法，其中，该方法包含：步骤1，进行目标细胞的培养和铺板；步骤2，配置microRNA/DNA/脂质体的混合物，对步骤1所述的细胞进行共转染；步骤3，进行荧光素酶活性检测；该步骤3包含：将步骤2所得的共转染后的细胞，用一种含有VEGFA基因3′UTR与报告基因的重组质粒，以及一种海肾荧光素酶载体分别进行转染；然后将得到的细胞经过培养后，进行收集；将所收集的细胞进行裂解；取15-20μl细胞裂解液于离心管中，加入工作液，然后用发光仪进行测读。该报告基因为萤火虫荧光素酶基因。本发明专利技术提供的方法，可用来筛选血管生成相关的microRNA、研究血管生成与microRNA之间的作用机理以及研究肿瘤细胞血管生成的机制等。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种重组质粒，具体地，涉及。
技术介绍
VEGFA 的全称为 vascular endothelial growth factor A,其中文名为血管内皮生长因子A。血管生成刺激因素包括有一类称为“血管生成因子(antigenic growthfactors) ”的细胞因子，起着刺激新血管形成的作用。目前已经发现了一些血管生成刺激因子，如血小板源性生长因子(TOGF)、成纤维细胞生长因子(bFGF)、转换生长因子(TGF)、血管内皮细胞生长因子A(VEGFA)等，其中在肿瘤血管生成中起关键作用的是VEGFA。·VEGFA蛋白由肿瘤细胞、巨噬细胞及纤维母细胞等分泌，广泛分布于人体许多组织，如腺体、肺、肝、肾、心肌等，但表达水平极低，其作用仅维持正常血管密度和基本渗透功能，维持营养物质。当出现肿瘤细胞之后，其表达水平一般会大大上升。有研究表明，VEGFA与肿瘤侵染性相关，与肿瘤易感性亦相关。VEGFA的主要功能包括(I)选择性增强血管内皮细胞有丝分裂，刺激内皮细胞增殖并促进血管形成。(2 )升高血管尤其是微小血管的渗透性，使血浆大分子外渗沉积在血管外基质中，为肿瘤细胞的生长和新生毛细血管网的建立提供营养。随着人类基因组计划的完成和模式生物基因组计划的进行，人们对于占人类基因组95%以上的非编码序列的研究日益加强，研究发现它们中很多是具有生物学功能和意义的片段，在这些研究之中，对于大小约21-23个碱基的单链小分子RNA的microRNA的研究则是最为热点之一。在近几年中的肿瘤的研究中，有关于microRNA对于肿瘤的功能与调控的研究一直是肿瘤治疗领域的热点之一，同时也取得了很大的突破与进展。目前研究表明，microRNA主要是通过结合到靶标基因的3 ' UTR区域，进而抑制靶标基因的转录，因此基因的3' UTR的抑制程度能够指示该基因受到miCToRNA抑制的水平。然而，现阶段对于血管生成与microRNA的相关研究报道并不多见,而对于VEGFA蛋白与microRNA的研究就更为少见了，同时目前也没有一种简便，快捷的方法来筛选能够抑制多药耐药蛋白的microRNAο
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种筛选血管生成相关microRNA的方法，利用含有血管内皮成长因子A (VEGFA)基因3' UTR序列和报告基因的重组质粒，进行血管生成相关的microRNA的筛选。为了达到上述目的，本专利技术提供了，其中，所述的方法包含步骤I，进行目标细胞的培养和铺板。优选人结肠癌细胞HCTl 16细胞培养于含有胎牛血清、青霉素、链霉素的RPMI 1640完全培养基(37°C 5% CO2、饱和湿度)中，并使之维持单层贴壁生长。然后在空板中接种指数生长期的细胞，在37°C 5% CO2培养箱中过夜培养，直到细胞到80%汇片。步骤2，配置microRNA/DNA/脂质体的混合物，对步骤I所述的细胞进行共转染。具体过程如下稀释质粒DNA及microRNA至RPMI 1640-SF培养液中，另外稀释脂质体至同样的RPMI 1640-SF培养液中，分别室温放置5 min。然后将所有上述稀释液混合，在室温放置20 min，使microRNA/DNA与脂质体结合。铺板细胞用RPMI 1640-SF培养液洗一次，在每个孔中加入microRNA/DNA/脂质体混合物。在37°C 5% CO2培养箱中培养3_5 h，吸去microRNA/DNA/脂质体/RPMI 1640-SF培养液混合物，每孔加入3ml新鲜培养液，在37°C5% CO2培养箱中培养24-48 ho步骤3，进行荧光素酶活性检测。该步骤三包含将步骤二所得的共转染后的细胞，用一种含有VEGFA基因3' UTR与报告基因的重组质粒，以及一种海肾荧光素酶载体PRL-SV40分别进行转染；然后将得到的细胞经过培养后，进行收集；将所收集的细胞进行裂解，即取出培养基，用PBS洗一次，在每孔中加入裂解液，室温摇动15 min;取15-20 μ I·细胞裂解液于离心管中，加入工作液，然后用发光仪进行测读。上述的利用双荧光素酶报告基因筛选血管生成相关microRNA的方法，其中，所述的工作液通过Kenreal试剂盒配置；所述的工作液包含用于测定萤火虫荧光素酶活性的工作液I和用于测定海肾荧光素酶活性的工作液2。该工作液I为A液(2 ml)+B液(40μ I) + C液(10 μ I)混合均匀而得。该工作液2为D液(2 ml) +E液(10 μ I)混合均匀而得。进行测读时，加入工作液1，设定延迟2 sec，发光仪测读10 sec ;加入工作液2，则设定延迟2 sec,发光仪测读10 sec。上述的利用双荧光素酶报告基因筛选血管生成相关microRNA的方法，其中，步骤3所述的报告基因为萤火虫荧光素酶基因。上述的利用双荧光素酶报告基因筛选血管生成相关microRNA的方法，其中，步骤3所述的含有VEGFA基因3 ^ UTR与报告基因的重组质粒，其制备方法包含步骤3. 1，对载体质粒进行扩增和抽提；步骤3. 2，对VEGFA基因的3' UTR序列进行克隆、酶切及纯化；步骤3. 3，进行所述的VEGFA基因的3' UTR序列与所述的载体质粒的连接；步骤3. 4，筛选重组子。上述的利用双荧光素酶报告基因筛选血管生成相关microRNA的方法，其中，所述的步骤3. I包含用所述的载体质粒转化大肠杆菌感受态细胞，进行扩增；然后采用碱裂解法抽提制备所述的载体质粒，电泳检测所述载体质粒的纯度和含量；再用NcoI和HindIII对所述载体质粒进行酶切，试剂盒凝胶回收大片段的酶切产物。碱裂解法是提取质粒的最常用也最有效的方法，是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异达到分离目的。其原理是高PH使质粒DNA和染色体DNA变性，同时沉淀蛋白质。再将pH值调至中性，质粒DNA较小，很容易复性成双链。而染色体DNA较大，不会复性，缠结成网状不溶物质，从而可以通过离心除去。具体方法为依次加入下面三种溶液，然后进行离心:溶液 I :葡萄糖 50 mmol/T,,EDTA 100 mmol/L,Tris-Cl 25 mmol/L,溶菌酶5mg/ml，调整 pH 为 8· O ;溶液 2 Na0H 0. 2 mol/L, SDS 1% ;溶液 3 :5 mol/L KAc 60 ml，冰乙酸11.5 ml，重蒸水28.5 ml。其中溶液I作用主要是悬浮菌体，溶液2作用是裂解菌体，释放胞内物质，溶液3是沉淀染色体DNA。上述的利用双荧光素酶报告基因筛选血管生成相关microRNA的方法，其中，所述的步骤3. 2包含步骤3. 2. 1，根据人的VEGFA基因的3' UTR区序列设计两端引物引物I为上游Y端引物，其中包含19个VEGFA基因的Y UTR互补碱基，一个HindIII识别位点，3个保护碱基；引物2为下游3'端引物，其中包含19个VEGFA基因3' UTR互补碱基，一个NcoI识别位点，4个保护碱基；步骤3. 2. 2，以基因组DNA为模板，利用PCR反应进行扩增；步骤3. 2. 3，反应结束后，取5 μ I反应产物用琼脂糖凝胶电泳检测；步骤3. 2. 4，取反应产物，琼脂糖凝胶电泳后，切胶，用凝胶本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用双荧光素酶报告基因筛选血管生成相关microRNA的方法，其特征在于，所述的方法包含：步骤1，进行目标细胞的培养和铺板；步骤2，配置microRNA/DNA/脂质体的混合物，对步骤1所述的细胞进行共转染；步骤3，进行荧光素酶活性检测；该步骤三包含：将步骤2所得的共转染后的细胞，用一种含有VEGFA基因3′UTR与报告基因的重组质粒，以及一种海肾荧光素酶载体分别进行转染；然后将得到的细胞经过培养后，进行收集；将所收集的细胞进行裂解；取15？20？μl细胞裂解液于离心管中，加入工作液，然后用发光仪进行测读。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：殷佩浩，李琦，邱艳艳，周利红，刘宣，王炎，秦建民，侯黎莉，梁波，胡送娇，包益洁，陈星竹，靳宝辉，宋大迁，叶乃菁，王一斐，
申请(专利权)人：上海中医药大学附属普陀医院，
类型：发明
国别省市：
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