本发明专利技术提供一种基于DNA三维纳米结构探针的电化学miRNA检测方法，包括：通过自组装的方法合成DNA三维纳米结构探针，DNA三维纳米结构探针包括延伸出的一段识别序列；将DNA三维纳米结构探针组装到电化学装置的工作电极表面；将目标miRNA与所述工作电极表面的所述DNA三维纳米结构探针杂交；加入氧化还原酶和相应的底物，使用电化学装置进行电化学检测。该方法可以检测低至10aM的miRNA，从而解决了现有技术中的检测方法需要大量的测试样品的难点。另外，该检测方法的特异选择性强，能够很好区分同族的miRNA的碱基错配。而且与利用单链DNA探针相比，本发明专利技术的方法稳定性更高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于核酸杂交检测领域，具体涉及。
技术介绍
微小RNA CmiRNAs)是一类新发现的长度为19_23个核苷酸的内源性非编码单链小分子RNA，通常在转录后水平调控细胞的增殖、分化、凋亡、代谢等过程。自从1993年Lee等最早在Caenorhabditis eIegan中发现参与调控线虫时序发育的lin_4后，人们对研究这些小分子在动植物基本生命过程中的重要作用产生了极大兴趣。大量的研究表明异常的miRNAs表达水平与人类多种类型的癌症直接相关(Nature ReviewsCancer, 2006, 6，259-269)，并且还发现血清和唾液中的miRNAs可以稳定存在而不被降解(Proc. Natl. Acad. Sci, 2008, 105，10513-10518)，这些性质突显了 miRNAs 作为癌症早期诊·断和无创诊断的标志物的价值和意义。无论是基础生物学研究还是癌症的早期诊断和筛选都迫切需要定量检测miRNAs的方法，然而由于miRNAs在体内的含量极少，序列短，相似性高并且容易被环境中的RNA酶降解等难点使得miRNAs的检测一直面临很多的技术挑战。Northern blotting —直被公认为是miRNAs检测的标准方法，但是由于它操作繁琐，费时费力，灵敏度相对较低并且样品需要量大(IOyg样品)等缺点使得它不适用于常规的临床诊断上。定量PCR (qPCR)和微芯片技术也是人们常用的miRNAs检测方法，但这些方法常常需要昂贵的仪器，复杂的操作,对miRNAs进行标记等,无法满足miRNAs床边检测(point-of-care tests, POCTs)的全部要求，例如不需要标记，不需要放大，在检测非常少的血清样品中miRNAs具有足够高的灵敏度和选择性，能够很好的区分miRNAs家族中f 2碱基的错配，廉价且便携适用于小型临床或者家庭诊断等。电化学传感器被认为是最有希望实现POCT的器件，目前已经有一些廉价而且小体积的电化学检测器存在(如基于电化学原理的家用血糖仪)(Nat.Protoc. ,2007. 2，2888-2895 ；Nature Chemistry, 2011. 3，697-703)。但是电化学DNA传感器的灵敏度常常由于异相电极表面的传质过程减慢和表面拥挤效应的影响使探针分子与目标DNA或RNA分子之间很难接触而受限制。目前的电化学传感器检测miRNAs的灵敏度大多在pM-fM范围，无法在不进行PCR前处理情况下直接检测十分微量的miRNAs。纳米结构表面的界面加工可以从热力学和动力学上大大改善分子间的识别能力，这一观点已经从理论和实验上都得到了证明(NatureNanotechnology, 2009. 4, 844-848 ；Nature Biotechnology, 2008. 26, 417-426)。随着DNA纳米技术的快速发展,人们已经可以高度可控地自下而上地组装精巧的DNA纳米结构。DNA纳米结构的界面工程在不需要借助工艺水平上的微加工技术就可以很方便的控制从溶液到空间立体结构的转变，并且能够增加表面探针与目标分子的接触机会。我们之前的研究也已经证明三维DNA纳米结构探针的三个顶点修饰巯基可以快速而又牢固地吸附到电极表面，形成有序、均相的DNA纳米结构自组装单分子层(SAM)用于生物传感研究(Adv. Mater. ,2010，22，4754-4758)。在此基础上，利用DNA三维纳米结构来进行DNA检测的方法也陆续出现，但是由于DNA和miRNA的结构和性质存在着巨大的差异，因此用于检测DNA的方法能否用于检测miRNA完全是无法预测的。例如专利申请(CN201010119941.9)公开了一种利用DNA三维纳米结构探针用于检测目标DNA的方法，其中，目标DNA、DNA三维纳米结构探针、DNA信号探针共同形成夹心结构，然 后利用电化学检测进行定量分析。同样，由于miRNA序列非常短(22nt左右)，与DNA探针进行杂交时的溶解温度(Tm)很低，因此不适用于形成夹心结构进行电化学检测。如果将待测的miRNA分成两段与DNA探针进行杂交，所涉及的Tm值会更低，常温下不稳定。因此，与形成夹心结构的检测方法相比，人们通常会选择与之截然不同的方法来对miRNA进行检测。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种利用DNA三维纳米结构探针的超灵敏的电化学miRNA的方法，解决了现有技术中的检测方法需要大量的目标miRNAs等缺点。本专利技术提供，包括(I)通过自组装的方法合成DNA三维纳米结构探针，所述的DNA三维纳米结构探针包括延伸出的一段识别序列；(2)将所述的DNA三维纳米结构探针组装到电化学装置的工作电极表面；(3)将目标miRNA与所述工作电极表面的所述DNA三维纳米结构探针杂交；(4)加入氧化还原酶和相应的底物，使用电化学装置进行电化学检测。通过上述简单的步骤，本专利技术提供了一种高灵敏度的检测miRNA的方法，该方法操作简单、不需要对目标miRNA进行标记和PCR扩增，具有成本低廉等优势。在所述步骤(I)中，所述的DNA三维纳米结构探针是由四条单链DNA自组装形成的四面体探针，所述的四条单链DNA中的三条单链DNA的5’端修饰有巯基，另一条单链DNA在一端延伸出所述识别序列。通过调整三条修饰有巯基的单链DNA的碱基数目，本专利技术所提供的方法可以根据实际需要调整该DNA三维纳米结构探针从工作电极表面突伸出的高度。通过调整识别序列，本专利技术所提供的方法可以根据目标miRNA的碱基进行适应性调整，从而满足各种不同的检测要求。在所述步骤(2)中，还包括将另一 DNA三维纳米结构探针组装到所述电化学装置的工作电极表面，所述另一 DNA三维纳米结构探针不具有所述识别序列。通过同时将具有识别序列的DNA三维纳米结构探针和不具有识别序列的DNA三维纳米结构探针同时组装到工作电极表面，可以调节工作电极表面的探针密度。由于该探针密度对于杂交效率的影响是十分关键的，通过该可选的步骤，可以找到最佳的组装密度以适合低浓度miRNA的杂交，从而提闻灵敏度。在所述步骤(2)中，所述的电化学装置的工作电极是金电极，通过巯基和金之间的金硫键将所述DNA三维纳米结构探针组装到电化学装置的工作电极表面。该金硫键可以将探针牢牢地固定于工作电极表面，无需其他辅助分子维持探针在界面上的形态，取向。DNA信号探针、所述DNA三维纳米结构探针与所述目标miRNA形成夹心结构。虽然通常来说识别序列无法与miRNA形成夹心结构用于电化学检测，但是本专利技术通过将识别序列负载在DNA三维纳米结构探针上，最终结合DNA信号探针与miRNA形成了夹心结构用于电化学检测，克服了现有技术中在检测miRNA时的偏见，这也就从一个侧面体现出本专利技术所涉及的DNA三维纳米结构探针的在稳定性上的优势。在所述步骤(3)中，所述DNA信号探针的序列和所述DNA三维纳米结构探针的所述识别序列彼此相邻地与所述目标miRNA的整个序列互补。即DNA信号探针的序列和DNA三维纳米结构探针的识别序列无间隔地相连，两者之间不具有缺口地与miRNA互补，从而利用DNA与RNA之间的氢键作用以及DNA之间的碱基堆积作用增强了 miRNA杂交本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于DNA三维纳米结构探针的电化学miRNA检测方法，其特征在于，包括：（1）通过自组装的方法合成DNA三维纳米结构探针，所述的DNA三维纳米结构探针包括延伸出的一段识别序列；（2）将所述的DNA三维纳米结构探针组装到电化学装置的工作电极表面；（3）将目标miRNA与所述工作电极表面的所述DNA三维纳米结构探针杂交；（4）加入氧化还原酶和相应的底物，使用电化学装置进行电化学检测。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：樊春海，闻艳丽，林美华，
申请(专利权)人：中国科学院上海应用物理研究所，
类型：发明
国别省市：
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