本发明专利技术揭示了一种乳糖化肝细胞靶向病毒载体的制备方法，包括：步骤一：将轮状病毒结构蛋白VP2或者VP6的基因构建到蛋白表达质粒pET系列载体上，得到表达质粒pET-VP2或者pET-VP6；步骤二：将pET-VP2或者pET-VP6转化大肠杆菌，表达出包涵体蛋白IB；步骤三：IB经复性和重新折叠后，形成蛋白R-VP2或者R-VP6；步骤四：将R-VP2或者R-VP6与抗癌药物进行交联，形成共轭物；步骤五：将共轭物进行自组装，形成携带有抗癌药物的病毒样颗粒；步骤六：将靶向配体乳糖酸共价交联到携带有抗癌药物的病毒样颗粒的外表面，得到乳糖化肝细胞靶向病毒载体。本发明专利技术能特异性识别肝癌细胞HepG2，使所携带的药物在肝癌细胞中能进行释放并产生细胞毒性，为肝癌的靶向药物治疗提供了新途径。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于病毒蛋白
，尤其涉及一种。
技术介绍
肝癌是很常见的肿瘤之一，在全球发病率日益上升，严重危害人类的生命健康。目前治疗肝癌的方法主要是化疗、手术、介入等手段，但效果都不够理想。随着基因科学和技术的日益发展，基因治疗肝癌成为了可能。基因治疗的关键问题是携带基因的载体问题，目前该领域技术发展迅速，常用的肝癌基因治疗载体主要有病毒载体、脂质体、质粒、阳离子聚合物等。其中，病毒载体效率高，但特异性差，应用一直不理想。乳糖酸(lactobionic acid，LA)是寡聚醛糖酸，其上的糖可以识别在肝细胞表 面高表达的脱唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoproteins receptor, ASGPR),因为ASGPR能与末端为半乳糖基的蛋白质或多肽发生特异性结合。研究显示，每个肝细胞可以表达IXlO5 5X105个ASGPR。ASGPR含有两个亚基，Hl和H2，两个亚基的比例是5:1，ASGPR和配体结合的是Hl亚基。一旦和配体结合后，它能使配体连接的纳米颗粒以笼状蛋白介导的方式进入肝细胞；而且，这样的入胞方式可以把外源物质输运到溶酶体，最后在溶酶体中进行降解。
技术实现思路
本专利技术的目的是利用乳糖酸对肝细胞的特异性识别作用，提出一种，为肝癌的靶向药物治疗提供新途径。本专利技术的目的将通过以下技术方案得以实现 一种，包括以下步骤 步骤一将轮状病毒结构蛋白VP2或者VP6的基因构建到蛋白表达质粒pET系列载体上，得到含有轮状病毒结构蛋白的表达质粒PET-VP2或者pET-VP6 ； 步骤二 将步骤一得到的含有轮状病毒结构蛋白的表达质粒PET-VP2或者pET-VP6转化大肠杆菌，表达出包涵体蛋白IB ； 步骤三所述包涵体蛋白IB经复性和重新折叠后，形成有活性的蛋白R-VP2或者R-VP6 ； 步骤四将步骤三得到的蛋白R-VP2或者R-VP6与抗癌药物进行交联，形成抗癌药物与蛋白R-VP2或者R-VP6的共轭物； 步骤五将步骤四得到抗癌药物与蛋白R-VP2或者R-VP6的共轭物进行自组装，形成携带有抗癌药物的病毒样颗粒； 步骤六将靶向配体乳糖酸共价交联到所述携带有抗癌药物的病毒样颗粒的外表面，得到乳糖化肝细胞靶向病毒载体。优选地，上述的，其中所述步骤五当中，先在pH值为4 9的缓冲液中进行自组装，温度为10°C 40°C，时间为3h 16h，自组装完成后在IOOOOrpm 30000rpm转速条件下进行离心分离,水洗后得到携带有抗癌药物的病毒样颗粒。优选地，上述的，其中所述缓冲液为碳酸钠-碳酸缓冲液，Tris-HCl缓冲液或者PBS缓冲液中的任意一种。优选地，上述的，其中所述抗癌药物为阿霉素、紫杉醇、喜树碱或者siRNA中的任意一种。优选地，上述的，其中所述步骤六包括先将EDC、NHS和乳糖酸混合反应，乳糖酸:EDC:NHS的摩尔比是(1: 1:10) (1:1:5)，反应2tT8h后，把β -巯基乙醇加入到反应液中淬灭EDC ;然后将携带有抗癌药物的病毒样颗粒 加入到反应液中，继续反应12tT20h，最终得到乳糖化肝细胞靶向病毒载体。本专利技术的突出效果为本专利技术利用乳糖酸对肝细胞的特异性识别作用，构建了乳糖化肝细胞靶向病毒载体，克服了病毒载体特异性差的问题，能特异性识别肝癌细胞!fepG2，使所携带的药物在肝癌细胞中能进行释放并产生细胞毒性，为肝癌的靶向药物治疗提供了新途径。附图说明图I是本专利技术实施例的流程示意 图2是本专利技术实施例的步骤六的反应结构 图3是本专利技术实施例的携带有阿霉素的病毒样颗粒DVLPs的原子力显微镜图片(A)和透射电镜图片(B)，标尺分别为200nm和50nm ； 图4是本专利技术实施例的免疫点杂交鉴定 图5是乳糖酸的标准曲线 图6是本专利技术实施例的DVLPLAs的原子力显微镜图片(A)和透射电镜图片(B)，标尺分别为 200nm 和 50nm ； 图7是本专利技术实施例的免疫荧光检测DVLPLAs在肝癌细胞IfepG2中的分布 图8是本专利技术实施例的不同浓度的乳糖酸封闭乳糖酸受体后的药物输运系统进入肝癌细胞H印G2的荧光显微镜图片； 图9是本专利技术实施例的免疫荧光检测DVLPLAs在细胞A549，MCF-7和Hela中的分布 图10是本专利技术实施例的DVLPLAs和阿霉素对HepG2细胞的毒性和浓度的关系图。具体实施例方式下面以轮状病毒结构蛋白VP6为具体实施例，对本专利技术技术方案作进一步说明，实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。同样的方案也适用于轮状病毒结构蛋白VP2，而且，通过对各个步骤相应条件的选择和替换，可以形成多种具体实例，它们均在本专利技术要求保护的范围之内。本实施例的一种，如图I所示，包括以下步骤步骤一将轮状病毒(Rotavirus，RV)结构蛋白VP6的基因构建到载体pET28a上，得到质粒 pET-VP6 ； 步骤二 将步骤一得到的质粒pET-VP6转化大肠杆菌,表达出包涵体蛋白(InclusionBody, IB)； 步骤三包涵体蛋白IB经复性和重新折叠后，形成有活性的蛋白R-VP6 ； 步骤四将蛋白R-VP6与阿霉素(DOX)进行交联，交联的形式可以是利用蛋白上的氨基、羧基或巯基进行化学键交联，也可以是利用疏水性相互作用、静电吸附的物理方法进行物理交联，形成阿霉素与蛋白R-VP6的共轭物DVP6 ； 步骤五将DVP6进行自组装，自组装的方法如下在pH值为4 9的缓冲液中进行自组装，温度为10°C 40°C，时间为3h 16h。自组装完成后在IOOOOrpm 30000rpm转速条件下进行离心分离，水洗后得到携带有阿霉素的病毒样颗粒DVLPs，其中缓冲液为碳酸钠-碳酸缓冲液，Tris-HCl缓冲液或者PBS缓冲液中的任意一种，优选PBS缓冲液； 步骤六=DVLPs外表面有四个赖氨酸分子可以提供氨基进行进一步的化学交联(kll8，kl23, kl25 and kl45)，通过EDC反应，将靶向配体乳糖酸共价交联到DVLPs的外表面，得到乳糖化肝细胞靶向病毒载体DVLPs-LA(DVLPLAs)，其方法如下先将I-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和乳糖酸(LA)混合反应，把乳糖酸上的羧基变成活泼酯，LA:EDC:NHS三者的摩尔比是(1: 1:10) (1: 1:5)，反应2h 8h后，把β -巯基乙醇加入到反应液中淬灭EDC ;然后将携DVLPs加入到反应液中，继续反应12h 20h，最终得到乳糖化肝细胞靶向病毒载体DVLPs-LA (DVLPLAs)。反应完成后，用水透析48h，充分透析除去未反应完的小分子物质，其反应过程如图2所示。本实施例的检测实验和结果如下 O原子力显微镜和透射电镜对携带有阿霉素的病毒样颗粒DVLPs的形貌表征如图3所示，原子力显微镜图片(A)和透射电镜图片(B)中观察到40nm 120nm的DVLPs,结果显示，VP6在交联了阿霉素后自组装形成的DVLPs的粒径比单独的VP6自组装的VLPs稍大，这可能是因为阿霉素交联后引起的。同时，交联后更容易组装，这是因为阿霉素所带的正电荷在一定程度上本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种乳糖化肝细胞靶向病毒载体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：步骤一：将轮状病毒结构蛋白VP2或者VP6的基因构建到蛋白表达质粒pET系列载体上，得到含有轮状病毒结构蛋白的表达质粒pET？VP2或者pET？VP6；步骤二：将步骤一得到的含有轮状病毒结构蛋白的表达质粒pET？VP2或者pET？VP6转化大肠杆菌，表达出包涵体蛋白IB；步骤三：所述包涵体蛋白IB经复性和重新折叠后，形成有活性的蛋白R？VP2或者R？VP6；步骤四：将步骤三得到的蛋白R？VP2或者R？VP6与抗癌药物进行交联，形成抗癌药物与蛋白R？VP2或者R？VP6的共轭物；步骤五：将步骤四得到抗癌药物与蛋白R？VP2或者R？VP6的共轭物进行自组装，形成携带有抗癌药物的病毒样颗粒；步骤六：将靶向配体乳糖酸共价交联到所述携带有抗癌药物的病毒样颗粒的外表面，得到乳糖化肝细胞靶向病毒载体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：赵庆欢，刘红海，乐晓桐，李咏梅，顾莉娟，
申请(专利权)人：苏州百拓生物技术服务有限公司，
类型：发明
国别省市：
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