合成双功能复合物的方法技术

本发明专利技术公开了一种合成包含反应产物和编码区域的双功能复合物的方法。该复合物是新生双功能复合物和构件之间的杂交产物。新生双功能复合物包含连接到寡核苷酸标识符区的连接实体，构件包含和与该标识符区足够互补以允许杂交的寡核苷酸连接的功能实体。然后，功能实体可通过化学反应转移到连接实体上。互补标识符区还包含独特密码子，它明确地标识该功能实体。该密码子在使用酶(例如聚合酶)延伸该标识符区域时用作模板以形成独特密码子。独特密码子可用于解码几轮功能实体转移后反应产物的合成历史。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于得到包含展示分子部分和编码部分的双功能复合物的方法。本专利技术还涉及一种用于生成双功能复合物库的方法，一种用于鉴定具有预选性能的展示分子的方法。
技术介绍
已经开发出能够对多肽和其它生化聚合物进行合成编码的方法。该方法的一个例子公开于US 5，723，598，其中涉及双功能分子库的生成。双功能复合物的一个部分是多肽且另一部分是包含用于编码和鉴别已参与形成多肽的氨基酸的核苷酸序列的标识符寡核苷酸。在生成双功能分子的库之后，在对靶亲和性方面进行分配且双功能分子的标识符寡核苷酸部分利用PCR进行扩增。最终，PCR扩增子被测序和解码用于鉴别具有靶亲和性的多肽。双功能复合物库通过一种通常称作分开-和-混合的方法而制成。该方法意味着接头分子被分开至空间分离的隔室中并在每个隔室中在一端与特定氨基酸前体反应并在另一端通过正交化学反应添加编码该特定氨基酸前体的核酸标签。随后，收集(混合)各隔室的内容物并随后再次分开至数个隔室，用于新一轮的与氨基酸前体和核苷酸标签的交替反应。继续该分开-和-混合法直至多肽达到所需长度。该已有技术方法在其应用中受到局限，因为用于加入化学单元或用于加入核苷酸或寡核苷酸序列的两种交替合成步骤之间必须存在相容的化学。根据已有技术，合成相容性问题通过在合成交替聚合物时正确选择相容的保护基团，和通过正确选择用于在一种生长中的聚合物保持被封闭的同时选择性地去保护另一生长中的聚合物的方法而解决。Halpin和Harbury在WO 00/23458中建议了另一方案，其中所形成的分子不仅被核酸标签鉴别而且被它指导。该方案也基于分开-和-混合技术，其中使用两个或多个合成步骤得到组合库。使用多个核酸模板，其中每个在一端具有化学反应部位点和在整个链中分散多个密码子区域，每个所述密码子区域又规定不同的密码子。模板通过密码子杂交至固定化探针上而分离和随后每个链在化学反应部位与特定选择的试剂反应。随后，所有的链被集中并基于第二密码子区域进行第二分配。该分开-和-混合法进行合适的次数以得到通常IO3至IO6种不同的化合物的库。该方法的缺点在于必须提供大量的核酸模板。如果需要IO6种不同化合物的最终库，必须合成总共IO6个核酸模板。这种合成一般麻烦或昂贵，因为核酸模板必须具有相当的长度以确保密码子区域和探针之间足够的杂交。在WO 02/074929中，公开了一种用于合成化合物的方法。这些化合物通过起始将包含反密码子和反应性单元的转移单元与具有与其相连的反应性单元的模板在允许反密码子杂交至模板上的条件下接触和随后使反应性单元反应而合成。另外，该方法的缺点在于，必须起始提供大量的核酸模板。使用模板的已有技术方法的缺点在于，编码取决于反密码子和模板之间的鉴别。两种寡核苷酸之间的杂交可在两者之间存在足够互补性时发生。有时，杂交甚至在寡核苷酸之间不存在完全匹配的情况下发生。其后果是，如果存在多个转移单元，那么有时模板的密码子序列不对应于实际反应的反应性单元。该不希望的后果在希望形成库时甚至更加明显，因为多个模板和构件被估计在反应介质中相互寻找。如果杂交步骤不完全适当，会产生被在模板上的不正确密码子编码的分子。这对针对该库进行的选择方法产生两种主要作用。首先，具有编码结合配体的密码子组合的模板会在选择过程中损失。第二，而且更重要的是，具有编码非结合性配体的密码子组合的模板将被富集。本专利技术的一个方面的目的是提供一种用于得到被编码分子的非模板依赖性方法，所述方法使得多种化学能够被应用于被编码分子的形成，因为可避免相容的正交保护基团在被编码分子和寡核苷酸标签的交替形成中的应用。本专利技术在一个优选方面意欲改进以前 在密码子鉴别过程中显示的易错杂交方法。另外，本专利技术的目的是减少所形成的非特异性反应产物。因此，在本专利技术的一个方面，本方法具有固有校正性质以确保表现型被基因型准确地编码。
技术实现思路
本专利技术涉及一种用于得到包含展示分子(display molecule)部分和编码部分的双功能复合物的方法，其中包含化学反应部位和用于酶加入标签(tag)的引发部位(priming site)的新生双功能复合物在化学反应部位与一种或多种反应物反应,并且在引发部位上使用一种或多种酶给该复合物提供标识反应物的各自的标签。酶一般是底物特异性的，因此标签至引发部位上的酶加入不可能干扰正在形成的展示分子。因此，保护基团在编码部分以及新生展示分子上的应用因此可被避免。但可因为其它原因需要保护正生长中的展示分子。可得到在含水和有机介质中具有活性的酶。但大多数酶在水介质中具有高于在有机介质中的活性。因此，在提供标签之前或之后，可能需要改变介质以得到可用于反应物在化学反应部位上反应的条件。一般，展示分子部分通过一种或多种反应物和化学反应部位之间一轮以上的反应而形成。在本专利技术的某些方面，与一种或多种反应物反应和提供有各自的标签的新生双功能复合物进一步一次或多次与一种或多种反应物反应和向其提供各自的标识标签，得到作为双功能复合物的一部分的反应产物和包含标签的标识部分，所述标识部分编码已参与形成反应产物的反应物的身份(identity)。在本专利技术的某些方面，反应的轮或周期是指，单个反应物与化学反应部位反应且用于标识反应物的各自的标签被提供在用于酶加入的引发部位上。在本专利技术的另一方面，一轮反应意味着多个反应物在化学反应部位上反应且用于标识一种或多个，但不必所有的，反应物的标签被提供在用于酶加入的引发部位上。在化学反应部位上的反应和标签的加入可按照任何顺序发生，即反应可在标签加入之后，同时，或之前发生。对顺序的选择可取决于酶种类，反应条件，和反应物种类，以及其它。新生双功能复合物包含化学反应部位和用于标签的酶加入的引发部位。任选地，新生双功能复合物还包含连接部分(linking moiety),它连接化学反应部位与引发部位。连接部分可用于各种目的，如使引发部位与化学反应部位彼此相距足够远以允许酶进行标签加入和提供杂交区域。在本专利技术的一个方面，连接部分是核酸序列。寡核苷酸的长度优选适用于与互补性寡核苷酸杂交，即连接部分中的核苷酸的数目合适地是8或以上。在某些实施方案中，连接部分通过间隔基连接到化学反应部位上，间隔基包含可选择性地断裂的接头以使展示分子能够在形成最终双功能复合物之后的步骤中脱离编码部分。新生双功能复合物也被称作生长中的复合物和表示待根据本专利技术方法处理的起始或中间复合物。中间复合物表示已进行一轮或多轮反应物反应和标签加入的起始复合物。化学反应部位可包含单个或多个能够与一种或多种反应物反应的反应基团。在某些方面，化学反应部位包含连接有一个或多个反应基团的支架(scaffold)。合适的反应基团的例子包括胺，羧酸，硫(thio)，醛，和羟基基团。支架的例子包括苯并二氮杂笨类，甾族’乙内酰脲类(hydantiones)，哌嗪类，二酮哌嗪类，吗啉类,托烷类,香豆素类,喹啉类,吲哚类，呋喃类，吡咯类，藝唑类，氨基酸前体，和噻唑类。另外，化学反应部位的反应基团可以是在可与反应物进行反应之前必须被活化的前形(pro-form)。例如，反应基团可用合适的基团保护，后者需要在可与反应物进行反应之前被去除。本说明书或权利要求中的展示分子表示已与一种或多种反应物反应的本文档来自技高网...

【技术保护点】
新生双功能复合物，其包含：a)通过化学反应部位与反应物反应得到的反应产物，其中，化学反应部位通过连接部分与标识该化学反应部位的第一寡核苷酸标签连接，其中，第一寡核苷酸标签包括用于通过酶催化来加入第二寡核苷酸标签的引发部位，b)标识反应物的第二寡核苷酸标签，和c)互补的寡核苷酸，它杂交到所述的第一核苷酸标签和第二寡核苷酸标签的每一个上。

【技术特征摘要】
2002.10.30 DK 200201652;2002.12.19 DK 200201955;21.新生双功能复合物，其包含 a)通过化学反应部位与反应物反应得到的反应产物， 其中，化学反应部位通过连接部分与标识该化学反应部位的第一寡核苷酸标签连接， 其中，第一寡核苷酸标签包括用于通过酶催化来加入第二寡核苷酸标签的引发部位， b)标识反应物的第二寡核苷酸标签，和 c)互补的寡核苷酸，它杂交到所述的第一核苷酸标签和第二寡核苷酸标签的每一个上。2.权利要求I的新生双功能复合物，其中，连接部分是核酸序列。3.权利要求I的新生双功能复合物，其中，连接部分中的核苷酸数目为8个或更多。4.权利要求I的新生双功能复合物，其中，连接部分通过间隔基连接到化学反应部位上，间隔基包含可选择性地断裂的接头以使反应产物能脱离寡核苷酸标签。5.权利要求I的新生双功能复合物，其中，反应产物通过共价键与第一核苷酸标签连接。6.权利要求5的新生双功能复合物，其中，共价键是环加成产物。7.权利要求5的新生双功能复合物，其中，共价键是烷基化产物。8.权利要求5的新生双功能复合物，其中，共价键是芳基化产物。9.权利要求5的新生双功能复合物，其中，共价键是酰基化产物。10.权利要求5的新生双功能复合物，其中，共价键是酰胺键。11.权利要求5的新生双功能复合物，其中，共价键是羧酸酯键。12.权利要求5的新生双功能复合物，其中，共价键是磺酰胺键。13.权利要求5的新生双功能复合物，其中，共价键是二硫键。14.权利要求5的新生双功能复合物，其中，共价键是S-烷基键。15.权利要求5的新生双功能复合物，其中，共价键是NR-烷基键。16.权利要求5的新生双功能复合物，其中，共价键是O-烷基键。17.权利要求5的新生双功能复合物，其中，共价键是芳基-乙烯基键。18.权利要求5的新生双功能复合物，其中，共价键是炔-乙烯基键。19.权利要求5的新生双功能复合物，其中，共价键是肟键。20.权利要求5的新生双功能复合物，其中，共价键是亚胺键。21.权利要求5的新生双功能复合物，其中，共价键是双环产物。22.权利要求5的新生双功能复合物，其中，共价键是三唑。23.权利要求5的新生双功能复合物，其中，共价键是己烯。24.权利要求I的新生双功能复合物，其中，化学反应部位包含能与I种或多种反应物反应的单个反应基团。25.权利要求I的新生双功能复合物，其中，化学反应部位包含能与I种或多种反应物反应的多个反应基团。26.权利要求I的新生双功能复合物，其中，化学反应部位包含连接有一个或多个反应基团的支架。27.权利要求24-26任一项的新生双功能复合物，其中，一个或多个反应基团选自胺基团、羧酸基团、硫基团、醛基团和羟基基团。28.权利要求26的新生双功能复合物，其中，支架选自苯并二氮杂輩类、留族、乙内酰脲类、哌嗪类、二酮哌嗪类、吗啉类、托烷类、香豆素类、喹啉类、吲哚类、呋喃类、吡咯类、1 唑类、氨基酸前体和噻唑类。29.权利要求I的新生双功能复合物，其中，可使用标准PCR技术扩增寡核苷酸标签。30.权利要求I的新生双功能复合物，其中，寡核苷酸标签由允许酶识别该寡核苷酸作为底物的主链结构组成。31.权利要求30的新生双功能复合物，其中，寡核苷酸标签的主链结构是DNA或RNA。32.权利要求I的新生双功能复合物，其中，引发部位包含3’-OH。33.权利要求I的新生双功能复合物，其中，引发部位包含5’-磷酸基团。34.权利要求I的新生双功能复合物，其中，寡核苷酸标签长2至100个核苷酸。35.权利要求I的新生双功能复合物，其中，寡核苷酸标签长3至50个核苷酸。36.权利要求I的新生双功能复合物，其中，寡核苷酸标签长4至20个核苷酸。37.权利要求I的新生双功能复合物，其中，寡核苷酸标签长5至15个核苷酸。38.权利要求I的新生双功能复合物，其中，寡核苷酸标签的核苷酸由核酸碱基部分和主链单元组成，其中主链单元由糖部分和核苷间接头组成。39.权利要求38的新生双功能复合物，其中，寡核苷酸标签的核酸碱基选自天然存在的核酸碱基以及非天然存在的核酸碱基。40.权利要求38的新生双功能复合物，其中，核酸碱基选自嘌呤杂环、嘧啶杂环、以及其杂环类似物和互变异构体。41.权利要求38的新生双功能复合物，其中，核酸碱基选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、嘌呤、黄嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代-N6-甲基腺嘌呤、7-去氮黄嘌呤、7-去氮鸟嘌呤、N4，N4-桥亚乙基胞嘧啶、N6, N6-桥亚乙基-2，6- 二氨基-嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-(C3-C6)-炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假异胞嘧啶、2-羟基-5-甲基-4-三唑并吡啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤和次黄嘌呤核苷。42.权利要求38的新生双功能复合物，其中，核酸碱基选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶和尿嘧啶。43.权利要求38的新生双功能复合物，其中，主链单元选自44.权利要求38的新生双功能复合物,其中，主链单元的糖部分是戍糖。45.权利要求44的新生双功能复合物，其中，戊糖选自核糖、2’-脱氧核糖、2’ -O-甲基-核糖、2’ -氟-核糖和2’ -4’ -O-亚甲基-核糖(LNA)。46.权利要求38-42任一项的新生双功能复合物，其中，寡核苷酸标签的核苷酸的核酸碱基连接在戊糖的I’位上。47.权利要求38的新生双功能复合物，其中，连接寡核苷...

【专利技术属性】
技术研发人员：PO·弗里斯克加德，T·弗朗奇，A·H·古利艾夫，M·D·伦多夫，J·费尔丁，E·K·奥尔森，A·霍尔特曼，S·N·雅克布森，C·萨姆斯，S·S·格莱德，K·B·延森，H·佩德森，
申请(专利权)人：纽韦卢森公司，
类型：发明
国别省市：