定量分析循环肿瘤细胞的试剂及试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及定量分析循环肿瘤细胞的试剂及试剂盒。本发明专利技术人设计了适宜检测循环肿瘤细胞的探针，从而可配合流式细胞技术，快速、灵敏、准确地获得循环肿瘤细胞的测定结果。所述的探针可被制备成试剂盒，方便人们应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术术语生物技术和医学领域；更具体地，本专利技术涉及定量分析循环肿瘤细胞的试剂及试剂盒。
技术介绍
最新的研究表明，癌症从发病起就向血液循环中散播肿瘤细胞，即循环肿瘤细胞(CTC)。由于癌症的病情发展与CTC密切相关，所以检测血液中CTC的浓度可以用来诊断癌症、对癌症进行分期、动态地监控癌症及指导临床用药。以往的文献表明，一个正在生长的肿瘤每天向血循环中释放105-3X 106个肿瘤细胞。因此，这些循环肿瘤细胞(CTC)是一个灵敏的临床指标。最新的研究表明，CTC可以用来对多种癌症进行预后，包括乳腺癌、前列腺癌、直肠癌、肺癌等。所以，对CTC检测技术的研 究和开发也越来越多。1869年，Ashworth解剖晚期癌症病人，偶然发现其血样中含有CTC。此后，他的研究激发了学术界对CTC和肿瘤生长、恶化和扩散的研究。基于Ashworth的研究，Paget于1889年提出了癌症界著名的种子和土壤学说(seed and soil hypothesis)。此学说成功地阐释了癌症复发和转移的机理。癌症病人在用药时，病情虽然减轻或稳定，但是原发的肿瘤组织释放出来的CTC会以癌症干细胞的形式休眠于骨髓中。停药后，这些癌症干细胞又会生成新的CTC，释放于血液循环中，从而造成复发或转移。1975年，Bulter等发现一个由于治疗而逐步萎缩的乳癌肿瘤在24小时内向血循环中释放了 I. O5X IO7个CTC。这么大量的CTC足以造成远程扩散和次发肿瘤的生长。此发现说明CTC是癌症复发和治疗监控的重要指标。1998年，Racila等用亲和性磁子法从乳腺癌病人血样中分离了 CTC并加以分析。这是第一个系统性的针对CTC进行诊断的研究。此研究发现在13个健康人的血样中的CTC数量平均为I. 5个/mL，局部肿瘤的患者(早期)平均为15. 9个/mL，淋巴结扩散的患者(中期)平均为47. 4个/mL，而远程扩散的患者(晚期)平均为122个/mL。此后，科学家相继在直肠癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌、卵巢癌等的CTC研究中得到了相似的结果O以上这些研究表明CTC的数量可以用来动态地监控癌症病情的发展，然而目前本领域中，检测CTC的手段复杂，耗时长，准确性也有待提高，目前还缺乏实时、快速地检测CTC的方法和试剂。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供定量分析循环肿瘤细胞的试剂及试剂盒。在本专利技术的第一方面，提供一种检测循环肿瘤细胞的探针，结构如下A-B-C ；其中，A代表特异性结合循环肿瘤细胞的结合分子；B为无，或代表亲水性化学小分子，用于优化A与细胞表面抗原的结合；C代表可检测的标记分子；代表A、B和C之间的共价连接、偶联或偶合的关系。在一个优选例中，A选自针对循环肿瘤细胞特异性的抗体、配体、化学小分子或多肽；A对于循环肿瘤细胞的平衡解离常数(Kd)小于10_6mol/L。在另一优选例中，A选自抗乳癌的抗体，LHRH多肽或叶酸；或者B选自2 100聚(较佳地为4 16聚；更佳地为4 8聚)的聚氧乙烯双胺；半胱氨酸(较佳地为I 5个；更佳地I 3个)；或者 C选自为荧光标记。在另一优选例中，所述的突光标记选自Alexa Fluor 488琥拍酰亚胺酯，AlexaFluor 647 琥珀酰亚胺酯，FITC，PE, Cy3，Cy5，PE_Cy5 等。在另一优选例中,所述的突光标记是Alexa Fluor 488琥拍酰亚胺酯。在另一优选例中，A为抗乳癌的抗体；以及B为无。在另一优选例中，A为变异型黄体生成素释放激素(Luteinizing HormoneReleasing Hormone, LHRH),其氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示；以及B为四聚氧乙烯双胺。在另一优选例中，A为Y叶酸；以及B为半胱氨酸。在另一优选例中，半胱氨酸的个数是I 3个；更佳地为2个。在本专利技术的另一方面，提供所述的探针的用途，用于制备检测循环肿瘤细胞的试剂盒。在本专利技术的另一方面，提供一种检测循环肿瘤细胞的试剂盒，其中包含所述的探针。在另一优选例中，所述的试剂盒还包含对照品、参照品和/或使用说明书。在本专利技术的另一方面，提供一种检测循环肿瘤细胞的方法(较佳地，为非诊断性的方法)，所述方法包括将所述的探针加入到待测样品中，检测标记分子的含量，从而得知循环肿瘤细胞的量。在另一优选例中，所述的标记分子是荧光标记，通过流式细胞术来检测标记分子的含量。在另一优选例中，所述的待测样品是富集了循环肿瘤细胞的样品。较佳地，通过密度梯度离心实施富集。本专利技术的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。附图说明图I、CTC检测的线性和检测限分析结果。图2、Alexa Fluor 488偶联的Herceptin抗体标记的乳癌CTC。黄绿色的细胞为癌细胞。蓝色背景色是为了更清楚地显示荧光的癌细胞。左下角标尺大小为ΙΟμπι。图3、Alexa Fluor 488偶联的LHRH标记的前列腺癌CTC。黄绿色的细胞为癌细胞。蓝色背景色是为了更清楚地显示荧光的癌细胞。左下角标尺大小为ΙΟμπι。图4、Alexa Fluor 488偶联的叶酸探针标记的肺癌CTC。绿色的细胞为癌细胞。左下角标尺大小为ΙΟμπι。图5、采用荧光标记的叶酸探针分别标记病例I (肺癌患者)的阳性肺癌CTC (左图)和外参Fluospheres (右图)，流式细胞术对CTC含量的定量分析。图6、采用荧光标记的Herceptin抗体标记病例3 (乳腺癌患者)的阳性癌细胞(左图)和外参Fluospheres (右图)，流式细胞术对CTC含量的定量分析。图7、采用荧光标记的叶酸探针标记病例4 (肺癌患者)的阳性癌细胞(左图)和外参Fluospheres (右图)，流式细胞术对CTC含量的定量分析，其中上排图为化疗前的检测结果，下图为化疗后的检测结果。图8、用Alexa Fluor 647标记的LHRH-四聚氧乙烯双胺探针染色的前列腺癌细胞的结果。具体实施例方式为了改进循环肿瘤细胞的测定技术，本专利技术人作了大量的工作，设计了适宜检测 的探针，从而可配合流式细胞技术，快速、灵敏、准确地获得循环肿瘤细胞的测定结果。所述的探针可被制备成试剂盒，方便人们应用。术语如本文所用，所述的“循环肿瘤细胞(CTC) ”是指存在于血液(外周血)中的癌症(肿瘤)细胞，CTC的浓度可以诊断癌症、对癌症进行分期、预后等。 如本文所用，所述的“癌症”或“肿瘤”没有特别的限制，只要该“癌症”或“肿瘤”自发病起会向血液循环中散播癌症细胞或肿瘤细胞。例如选自(但不限于)鼻咽癌、食管癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、肺癌、宫颈癌、白血病、口腔癌、唾液腺肿瘤、鼻腔与鼻旁窦恶性肿瘤、喉癌、耳部肿瘤、眼部肿瘤、甲状腺肿瘤、纵隔肿瘤、胸壁、胸膜肿瘤、小肠肿瘤、胆道肿瘤、胰腺与壶腹周围肿瘤、肠系膜与腹膜后肿瘤、肾脏肿瘤、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、前列腺癌、睾丸肿瘤、阴茎癌、子宫内膜癌、卵巢恶性肿瘤、恶性滋养细胞肿瘤、外阴癌与阴道癌、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、软组织肿瘤、骨肿瘤、皮肤及附件肿瘤、恶性黑色素瘤、神经系统肿瘤、小儿肿瘤。作为本专利技术的优选实施方式，所述的“癌症”或“肿瘤”选自乳(腺)癌、肺癌、前列腺癌。如本文所用，所述的“平衡解离常数(equi本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测循环肿瘤细胞的探针，其特征在于，结构如下：A？B？C；其中，A代表特异性结合循环肿瘤细胞的结合分子；B为无，或代表亲水性化学小分子；C代表可检测的标记分子；“？”代表A、B和C之间的共价连接、偶联或偶合的关系。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：何伟，杨国华，吕娟，韩宁宁，
申请(专利权)人：妙华思博生物科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：