特异识别沙门氏菌的寡核苷酸适配子的用途制造技术

本发明专利技术涉及特异识别沙门氏菌的寡核苷酸适配子的用途。所述寡核苷酸适配子是一条78个碱基长的单链DNA，其在沙门氏菌O8检测中的应用。本发明专利技术以食源性沙门氏菌O8为目的靶分子，同时以大肠杆菌O86:K61和猪霍乱沙门氏菌为反筛菌，获得了一条沙门氏菌O8特异的适配子。本方法具有检测时间短、研发周期短、质量稳定、操作简单等优点，在食品与卫生安全检测中得到广泛应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物学、食品与卫生检测
，具体涉及特异识别沙门氏菌(血清型08，以下简称沙门氏菌08)的寡核苷酸适配子的用途。
技术介绍
目前，国内外在食品中沙门氏菌检测时常用的检测方法因其检测手段、识别对象各有不同而各具优缺点。传统检测沙门氏菌的方法需要先分离再培养，然后用经典的方法鉴定，耗时、不灵敏是这些方法普遍存在的问题。免疫学方法简单、方便、迅速、特异性较好，但是仍有交叉反应比较严重、假阳性多、灵敏度偏低等不足之处。聚合酶链式反应(PCR)技术虽具有准确、灵敏、快速的特点，但其在检测数目较多的样品时操作比较繁杂，因此在聚合酶链式反应(PCR)技术的基础上又衍生出很多新型聚合酶链式反应(PCR)技术，如多重 PCR技术，然而多重PCR虽简化了 PCR实验的操作，但是由于该技术需数对引物同时进行扩增，很容易产生非特异性条带或假阳性，影响检测結果。通过指数富集配体的系统进化(Systematic evolution of ligands byexponential enrichment, SELEX)技术筛选获得的寡核苷酸序列称为适配子(aptamer)。其原理就是利用分子生物学技术，构建人工合成的单链随机寡核苷酸文库，其随机序列长度在20-100个碱基左右，将随机寡核苷酸文库与靶分子相互作用，保留结合的寡核苷酸配基，经反复扩增、筛选数个循环，即可使与该靶子特异结合的寡核苷酸序列得到富集，最終获得靶分子的特异寡核苷酸配基。该技术具有库容量大、靶分子范围广、亲和力高、特异性强等优点。在临床检测方面，特别是对ー些未知的致病性细菌或病毒的研究，虽然不知道其内部结构、功能以及这些物质的表位，但将其作为靶物质，通过SELEX技术筛选到其相应的适配子，以检测靶物质，已成为该领域的研究热点。利用SELEX技术筛选获得的适配子识别分子的模式与蛋白抗体类似，但与蛋白类抗体相比，核酸类配基具有更多的优越性，如不受免疫条件和免疫源性限制，可体外人工合成，变性与复性可逆，可修饰并有利于长期保存和室温运输等。更重要的是，适配子的靶分子更为广泛，包括金属离子、有机染料、氨基酸、细胞因子、辅因子、氨基糖苷、抗生素、碱基类似物、核苷酸和多肽等。其中蛋白质类靶分子最多，包括酶、生长因子、抗体、转录因子、细胞粘附分子和选择素等。完整的病毒颗粒和细菌病原体，甚至完整的细胞也可以通过复合靶子SELEX技术或消减SELEX技术筛选出高亲和カ的寡核苷酸配基。适配子比抗体具有更高的特异性和精确识别能力，甚至能识别单抗不能区分的蛋白质分子。这些特性使得适配子在生物医药和食品卫生研究領域得到广泛应用，成为不可缺少的有力工具。
技术实现思路
为了解决现有沙门氏菌检测中存在的检测周期长、灵敏度低、假阳性多等问题，本专利技术提供一种特异识别沙门氏菌的寡核苷酸适配子的应用。特异识别沙门氏菌的寡核苷酸适配子的核苷酸序列如下5’ -GATCCGGGCCTCATGTCGAACACCCCCCAACTAAAACAACAAAACACCACCGCCATTGAGCGTTTATTCTGAGCTCCCA-3’，特异识别沙门氏菌的寡核苷酸适配子是一条78个碱基长的单链DNA。本专利技术通过SELEX技术的筛选过程，获得高亲和性特异识别沙门氏菌的寡核苷酸适配子，用于快速、准确检测沙门氏菌08。本专利技术以倉源性沙门氏菌08为目的靶分子，同时以大肠杆菌086:K61和猪霍乱沙门氏菌为反筛菌，获得了一条沙门氏菌08特异的适配子。本方法具有检测时间短、研发周期短、质量稳定、操作简单等优点，在食品与卫生安全检测中得到广泛应用。附图说明图I为单链寡核苷酸(ssDNA)富集库与沙门氏菌08结合率的测定结果图。图2 A为寡核苷酸适配子10号与沙门氏菌08灵敏度测定结果图。图2 B为寡核苷酸适配子9号与沙门氏菌08灵敏度测定 结果图。图3A为荧光显微镜观察荧光基团标记寡核苷酸适配子10号与大肠杆菌结合比较图。图3B为荧光显微镜观察荧光基团标记寡核苷酸适配子10号与猪霍乱沙门氏菌结合比较图。图3C为突光显微镜观察突光基团标记寡核苷酸适配子10号与沙门氏菌08结合比较图。图3D为荧光显微镜观察荧光基团标记寡核苷酸适配子10号与双蒸水结合洗脱后空白对照图。具体实施例方式特异识别沙门氏菌的寡核苷酸适配子的核苷酸序列如下5’-GATCCGGGCCTCATGTCGAACACCCCCCAACTAAAACAACAAAACACCACCGCCATTGAGCGTTTATTCTGAGCTCCCA-3’ ；特异识别沙门氏菌的寡核苷酸适配子是一条78个碱基长的单链DNA。本专利技术通过SELEX技术的筛选过程，获得高亲和性特异识别沙门氏菌的寡核苷酸适配子，用于快速、准确检测沙门氏菌08。下面通过SELEX筛选获得沙门氏菌08特异的寡核苷酸适配子，并对其中亲和カ最高的一条寡核苷酸适配子对沙门氏菌08识别和鉴定作进ー步说明。I.随机单链DNA文库和引物由上海生物工程有限公司合成 随机单链 DNA 文库5’ -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-35nt-TTCGACATGAGGCCCGGATC-3’ (注nt 代表 A、T、C、G 碱基中任意ー种) 引物 I : 5 ’ - GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-3’ 引物 II : 5 ’ -GATCCGGGCCTCATGTCGAA-3，引物III : 5’-地高辛- GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-3’引物IV :5’ -生物素-GATCCGGGCCTCATGTCGAA-3’。2.沙门氏菌08 {Salmonella嫩)的制备 沙门氏菌08 {Salmonella 08’购自中国エ业微生物菌种保藏管理中心CICC)接种于营养琼脂平板37°C培养15 18小时，刮取菌苔于O. 9%无菌生理盐水试管，6000 rpm 4°C离心10 min，洗涤菌体3次，弃上清，重悬于O. 9%无菌生理盐水，用比浊仪调浊度为O. 5，约相当于I. 5X 108/ml沙门氏菌08菌悬液。3. SELEX筛选获得沙门氏菌08特异的寡核苷酸适配子 I)SELEX筛选过程 a.首轮筛选，取合成的随机单链DNA1/3 OD (I(^g)加入到400ul IX结合缓冲液，95度变性5min，然后迅速置于冰上IOmin ； b.加入ImL菌悬液I.5X IO8 ,于37° C摇床100 rpm结合I小时(以后可减少结合时间)，使单链DNA文库与菌充分作用； c.更换离心管，以去除与管壁结合的单链DNA,室温下离心10000 rpm离心 IOmin分离未与菌结合的单链DNA文库； d.弃上清,加入600μ IX冲洗缓冲液,离心10 000 rpm离心IOmin,重复此过程4次，目的是洗去未与菌结合的核酸片段； e.接上步离心后去上清，加入IOOPL去离子水99°C加热3min，高速离心18 000rpm离心15min弃沉淀，换管留上清(核酸片段存于上清中)，-20° C保存备用。2) PCR富集与沙门氏菌08特异结合的寡核苷酸适配子 每轮筛选后获得的与沙门氏菌08特异结合的寡核苷酸适配子文库通过PCR扩增得到富集； a.以上述上清为模板，通过引物I本文档来自技高网...

【技术保护点】
特异识别沙门氏菌的寡核苷酸适配子的用途，所述寡核苷酸适配子的核苷酸序列如下：5“？GATCCGGGCCTCATGTCGAACACCCCCCAACTAAAACAACAAAACACCACCGCCATTGAGCGTTTATTCTGAGCTCCCA？3“，其特征在于：所述寡核苷酸适配子是一条78个碱基长的单链DNA，其在沙门氏菌O8检测中的应用。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：余晓峰，张萍，宗凯，孙娟娟，李云飞，陈雪娇，郑海松，
申请(专利权)人：安徽出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：