编码杀虫蛋白的核苷酸序列制造技术

本发明专利技术涉及编码杀虫蛋白的核苷酸序列。具体地，本发明专利技术提供编码表现鳞翅目抑制活性的杀虫蛋白的核苷酸序列，以及在本文中称作Cry1A.105杀虫剂的新杀虫蛋白，表达该杀虫剂的转基因植物，和检测生物样品中该核苷酸序列或杀虫剂的存在的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术提供用于植物的新编码序列。该编码序列编码针对广泛鳞翅目物种作物害虫毒性的嵌合杀虫蛋白。
技术介绍
天然存在的苏云金芽孢杆菌(B. thuringiensis)分离物的商业制剂已长久用于对农业昆虫害虫的生物控制。根据常规农业实践将从苏云金芽孢杆菌物种发酵获得的Bt孢子和晶体浓缩并配制用于叶施用。 已知Cryl晶体蛋白家族成员表现出对抗鳞翅目昆虫幼虫的生物活性，并可用作控制鳞翅目昆虫害虫的试剂。Cryl δ-内毒素的前体形式由两个约相同大小的部分组成。前体蛋白的羧基末端部分或毒素原部分稳定晶体形成，且不表现杀虫活性。前体蛋白氨基末端这一半含有Cryl蛋白的毒素部分，且基于Cryl家族成员中保守或基本保守序列的比对，其可进一步再分为三个结构域。这三个亚结构域以CrylA δ -内毒素的三维晶体学结构模型为基础，其中如从蛋白毒素部分氨基末端所测量的，三个亚结构域分别称作结构域I、结构域II和结构域III。结构域I含有活性毒素部分的大约第一个三分之一，且已显示对于通道形成是关键的(Thompson等人，1995)。结构域II和III各含活性毒素部分的大约中部和羧基末端部分。依赖于所检查的昆虫和S-内毒素，结构域II和III均与受体结合和昆虫物种特异性牵连(Thompson等人，1995)。从本领域中已知的众多天然杀虫晶体蛋白结构域结构重配而任意产生性质增强的嵌合蛋白的可能性是渺茫的。这是蛋白质结构、折叠、寡聚化和活化的复杂本质的结果，所述活化包括对嵌合前体(如果以这种形式表达的话)的正确蛋白酶解加工以释放杀虫毒素部分。只有通过各亲本蛋白内针对包括入嵌合结构的具体靶区作出仔细的选择才能构建出与嵌合体所来源的亲本蛋白相比表现有改进的杀虫活性的功能性杀虫毒素。经验已显示，毒素结构域的重装配，即由任意两个或更多个彼此不同的毒素的结构域I、II和III组成的嵌合毒素的装配，导致构建出晶体形成有缺陷和/或完全缺乏针对优选靶昆虫害虫物种的任何可检测的杀虫活性的蛋白。在某些情况下，嵌合毒素将表现出良好的晶体形成特性，但仍不表现可检测的杀虫活性。只有通过尝试与错误才能配制有效的杀虫嵌合体，且尽管那样，本领域技术人员仍不必定最后得到表现与该嵌合体组分所来源的任何单个亲本毒素蛋白相比相同或改进的杀虫活性的嵌合体。文献报道了从两个或更多个Bt杀虫晶体蛋白前体构建或装配嵌合蛋白的例子，但是并非全部都表现与嵌合体所来源的前体蛋白相比等同或改进的杀虫或晶体形成特性(Bosch 等人(W095/06730) ;Thompson 等人(W095/30753) ;Thompson 等人(W095/30752)；Malvar 等人(W098/22595) ;Gilroy 等人(美国专利号 5，128，130) ;Gilroy (美国专利号5，055，294) ；Lee 等人(1992)Gene 267 :3115-3121 ；Honee 等人(1991)Mol. Microbiol. 5 2799-2806 ;Schn印f 等人(1990) J. Biol. Chem. 265 :20923-20930 ;Perlak 等人(1990) Bio/Technol. 8 :939-9943 ；Perlak 等人(1993)Plant Mol. Biol. 22 :313-321)。已经证明苏云金芽孢杆菌δ内毒素在转基因玉米植物中的表达是控制农业重要昆虫害虫的有效方法(Perlak等人1990 ; 1993)。表达苏云金芽孢杆菌δ内毒素的转基因作物能够使种植者显著减少与施用局部应用的化学杀虫剂有关的时间和成本。尤其有利的是编码苏云金芽孢杆菌S内毒素的转基因的使用。在严重昆虫压力的地区中表达苏云金芽孢杆菌S内毒素的作物植物表现出比其它方面类似的非转基因商业植物品种更好的改进产量。然而，据预测，昆虫将进化出针对转基因植物中表达的苏云金芽孢杆菌S内毒素的抗性。这样的抗性，若广泛流传的话，无疑将限制含有编码这样的苏云金芽孢杆菌δ内毒素基因的种质的商业价值。提闻转基因杀虫剂对抗祀害虫的有效性并同时减弱杀虫剂抗性害虫的发展的一种可能途径可以是确保转基因作物表达高水平的苏云金芽孢杆菌 δ内毒素(McGaughey和Whalon 1993 ;Roushl994)。此外，具有有效对抗多组昆虫害虫且通过不同作用模式显示其作用的杀虫基因库可以抵御任何抗性的发展。两种或更多种对相同昆虫物种具有毒性的杀虫组合物在植物中的表达，各杀虫剂以足够高以有效延迟抗性开始的水平表达，可是实现控制抗性发展的另一途径。这样的可用于这样的组合中的杀虫剂的例子包括但不限于Bt毒素、致病杆菌属物种(Xenorhabdus sp.)或光杆状菌属物种(Photorhabdus sp.)杀虫蛋白、脱变态反应和去糖基化patatin蛋白和/或permuteins、植物凝集素等。实现在相同植物中共表达多种杀虫活性蛋白，和/或那些杀虫蛋白的高表达水平而不产生所不期望的植物形态学效果，是难以捉摸的。从苏云金芽孢杆菌物种中已鉴定的超过二百五十种个别的杀虫蛋白中只有少数已被测试在植物中的表达。几种Cryl’ s、Cry3’ S、Cry2Aa和Cry2Ab、二兀毒素Cry33/34和Cry23/37、以及Cry9已在植物中成功表达。Cryl蛋白代表已在植物中表达但未以高水平表达的最大类蛋白。为避免不期望的植物毒性作用，必须将Cry2Ab靶向叶绿体。大部分种植重组植物的土地表达CrylA蛋白。所靶向的昆虫害虫物种对CrylA蛋白的抗性开始的可能性大大高于若抗性管理等位基因也与cryl等位基因一起表达，或者若cryl等位基因以高水平表达的可能性。因此，需要开发出在植物中表达的替代毒素基因作为那些目前在第一和第二代转基因昆虫抗性植物中使用的毒素基因的补充或替代。
技术实现思路
本专利技术提供在植物中表达的分离的核苷酸序列，其编码表现鳞翅目昆虫抑制特性的杀虫蛋白。SEQ ID NO 1是这样的核苷酸序列的例子，其由crylA. 105基因组成且编码昆虫抑制性CrylA. 105蛋白。SEQ ID NO :1与SEQ ID NO 3类似，二者均编码CrylA. 105蛋白。SEQ ID NO :I优选用于双子叶细胞中，而SEQ ID NO :3优选用于单子叶细胞中。SEQID NO 4由SEQ ID NO 3编码，且与SEQ ID NO 2的氨基酸序列相同。该分离的核苷酸序列意欲包括表现与SEQ ID NO :1所示序列至少约88%至约90%或更大的核苷酸序列同一性，或在严格杂交条件下与SEQ ID NO: I杂交的序列。该分离的核苷酸序列还意欲包括表现与SEQ ID NO :3所示序列至少约90%核苷酸序列同一性，或在严格杂交条件下与SEQ IDNO 3杂交的序列。本专利技术还提供表现针对鳞翅目昆虫物种的抑制活性的分离和纯化的杀虫蛋白。该杀虫蛋白在本文中至少被称为CrylA. 105毒素部分，且表现SEQ ID NO :2所示氨基酸序列。由SEQ ID NO 2中所示的约1177个氨基酸组成的全长前体蛋白也称作杀虫CrylA. 105蛋白，然而任何表现杀虫生物活性的前体蛋白片段也称作杀虫CrylA. 105蛋白，且至少本文档来自技高网...

【技术保护点】
控制转基因植物中灰翅叶蛾属昆虫侵袭并提供昆虫抗性控制的方法，其包括在植物中表达至少两种不同的对灰翅叶蛾属物种/昆虫有毒性的杀虫蛋白。

【技术特征摘要】
2005.08.31 US 60/713,1441.控制转基因植物中灰翅叶蛾属昆虫侵袭并提供昆虫抗性控制的方法，其包括在植物中表达至少两种不同的对灰翅叶蛾属物种/昆虫有毒性的杀虫蛋白。2.权利要求I的方法，其中所述至少两种不同的杀虫蛋白包括杀灰翅叶蛾属昆虫的VIP蛋白和杀灰翅叶蛾属昆虫的Cryl蛋白。3.权利要求2的方法，其中作为所述表达的结果，通过延迟摄食所述植物的灰翅叶蛾属昆虫群体中对所述VIP和Cryl蛋白的昆虫抗性的开始而提供所述昆虫抗性控制。4.权利要求I的方法，其中所述转基因植物是选自玉米、小麦、燕麦、稻、高粱、买罗高粱、荞麦、黑麦、羊茅、梯牧草、雀麦草、鸭茅、圣奥古斯丁草、狗芽根、剪股颖和大麦的单子叶植物。5.权利要求I的方法，其中所述转基因植物是选自苜蓿、苹果、杏、芦笋、豆、浆果、黑莓、蓝莓、低芥酸菜子、胡萝卜、花椰菜、芹菜、樱桃、鹰嘴豆、柑橘、棉花、豇豆、蔓越橘、黄瓜、葫芦、茄子、果树、葡萄、柠檬、莴苣、亚麻子、瓜、芥子、产干果的树、秋葵、橘、豌豆、桃、花生、梨、李、马铃薯、大豆、南瓜、草莓、甜菜、向日葵、甘薯、烟草、西红柿、芜菁和蔬菜的双子叶植物。6.权利要求2的方法，其中所述Cryl蛋白是CrylA蛋白。7.权利要求6的方法，其中所述CrylA蛋白是CrylA.105蛋白。8.控制转基因植物中灰翅叶蛾...

【专利技术属性】
技术研发人员：N·N·博达诺瓦，D·R·科尔宾，T·M·马尔瓦，F·J·佩尔拉克，J·K·罗伯茨，C·P·罗马诺，
申请(专利权)人：孟山都技术有限公司，
类型：发明
国别省市：