构建核酸库的方法、试剂及试剂盒技术

本发明专利技术为建立具有标签的核酸库提供了方法、试剂及试剂盒，并采用了体外转座的方法。首先用转座酶随机打断目标DNA，然后用核酸酶和DNA聚合酶处理，产生有标记的DNA文库。本发明专利技术允许连接任何所需标记的DNA片段，使所产生标记的DNA片段，可以直接应用到不同的第二代测序平台，包括但不限于由Illumina，Life?Technologies(ABI)，Roche，HelicosBiotechnologies，Pacific?Biosciences这些公司制造的仪器，同样也适用于其它厂商生产的测序仪。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术为建立核酸库提供了方法、试剂及试剂盒。特别是在建库过程中使用了转座酶、核酸酶和连接酶。
技术介绍
怎样有效和高效地用各种不同材料的DNA和RNA来建立文库，这对第二代测序 (NGS)的研究人员和操作人员来说是一个挑战。现有的技术，包括通过物理手段超声波法或雾化法来打断双链DNA，这需要较大量的起始材料。这个过程是漫长的，很难以高通量的方式进行。NEB的科学家最近开发使用Fragmentase，在离心管中进行酶反应，这和物理打断相比是一个不错的选择，但仍然需要大量的起始材料。EPICENTRE公司开发了 Nextera试齐U，从而使研究人员能够在2小时内完成建库过程，并且起始材料只要50ng。然而，它需要的测序引物与现有的测序平台的测序引物不兼容，这是让许多潜在用户感到失望的一点。第二代测序建库领域面临的另一个挑战是，测序平台发展非常快，新测序仪的研发只需要几年的时间，更新换代很快。第三代测序技术也有可能在不久的将来会对第二代技术进行挑战或替换。新技术和设备的快速发展，为那些只需进行很小的调整，就能将建库技术应用于新的仪器和技术平台的建库产品带来了技术和商业上的竞争力，也为那些企业带来了巨大的商业机会。本专利技术的目的是建立一个文库的制备方法，可用于所有现有的和即将推出的极少改动的新测序仪，可以用于高通量，并适用于机器操作，只需要较少的起始材料，即可产生满意的测序结果。
技术实现思路
本专利技术提供了随机断裂并同时标记DNA片段的方法，组分和试剂盒。特别是，本专利技术采用体外转座，用核酸酶和连接酶来标记核酸库以适合下一代测序应用。在一些实例中，本专利技术方法为随机断裂并同时标记DNA片段提供了方法，适用的 DNA片段可以是纯化的基因组DNA，双链的cDNA，PCR后的双链DNA产物，或是滚环复制产生的大片段DNA，这些DNA的来源可以是人，动物，植物或者微生物。其中包括a)将转座酶和转座子末端序列(Transposone End-TE)与双链目标DNA 混合，在转座酶的催化作用下，双链的转座子随机插入目标DNA序列中。转座酶可以包括 (Tn5，Τη3，Τη7，Τη8，Τη9，TnlO, Tnll, Τη2, Τη4，Τη6以及它们的各种突变版本。在转座子插入过程中，转座子末端的一条单链以共价键连接在DNA片断的5’端，转座子末端的第二条链与DNA片断不相连，但是在退火条件下，仍以双链形式存在。在第二链的转座末端和DNA 片段3’端之间有9个碱基的空位。由此就产生了随机断裂的，并被(TE)标记的DNA片段。 这些片段从5’至3’，始于双链转座子末端序列，继而是9个碱基对的单链DNA序列，然后是双链目标DNA片段，9bp的单链DNA序列和双链转座子末端；b)从转座子末端序列(TE) 标记的DNA片断中去除双链转座子末端序列(TE)，生成未标记的DNA片段；c)在未标记的、DNA片断上连接需要的DNA标记，产生一个新的有标记的DNA片段。在一些实例中，转座子可以包括(Tn5)，转座子末端序列可以包括(TE)。在本专利技术的一些实例中，单链DNA内切酶被用来切割9个碱基转座子末端序列 (TE)标记的DNA上9个碱基的单链区域，目的是移除双链转座子末端序列。许多单链DNA 内切酶能够用来去除单链DNA，以此除去DNA两端双链转座子末端序列，产生带有平末端的未被标记的双链DNA片断。在另外一些实例中，用DNA聚合酶来补平5’端，在3’端加上A 尾。适用于这一应用的聚合酶不仅仅局限于DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶，大片段DNA聚合酶I (Klenow片段)也可以使用。Klenow片段是去除了 3’到5’外切酶活性的DNA聚合酶I。而用DNA聚合酶补平5’端，形成平末端(而不是A尾)，则要用有3’到5’外切酶活性的DNA聚合酶，如T7DNA聚合酶，T4DNA聚合酶，大片断DNA聚合酶I等。在一些实例中，转座子末端的第二条链，是游离的，并不和目标DNA序列共价连接。在高温条件下，转座子末端序列(TE)标记的DNA片段被分离，而目标DNA部分保持不变。在移除转座子末端的第二条链后，可以使用一些特定的单链DNA核酸酶来移除剩下的转座子的第一条链和9个碱基对的单链DNA。在本专利技术的一些实施方案中，被随机断裂的目标DNA需要被加上有特殊要求的标签，产生标记的DNA片段以适用于下游应用的需要。DNA连接酶，如T4DNA连接酶可把标记的DNA与DNA片断连接起来。根据下游应用需要的DNA片段，可以加上所需的标签如测序标签，b arcode标签,地址标签,酶切位点标记，捕捉标记，检测标记，扩增标记，或转录启动子序列标签。多个标记也可以连接在一起使用。在未标记的双链DNA片段的两端可以连接相同或不同的标签。在一些实例中，所需的序列标签是由许多二代测序公司提供的，如 Illumina,Life Technologies,Roche,Complete Genomics and Pacific Biosciences 等。在一些实施例中，本专利技术提供了一种用于随机断裂，并形成有标记的DNA片段的试剂盒，其中包括纯化的转座子，转座子末端(TE)，和单链DNA核酸酶。该试剂盒还可以包括DNA聚合酶，例如，DNA聚合酶I，大片段DNA聚合酶I (Klenow片段)或Taq DNA聚合酶。在一些实施例中，该试剂盒还包括DNA连接酶，例如，T4DNA连接酶，。在一些实施例中， 该试剂盒还可以包括所需的标签，可以是一个或多个测序标签，barcode标签,地址标签， 酶切位点标记，捕捉标记，检测标记，扩增标记，或转录启动子序列标签。在一些实施例中， 所需的序列标签是由许多二代测序公司提供的，如Illumina, Life Technologies, Roche, Complete Genomics and Pacific Biosciences 等。本专利技术采用在体外转座系统，将目标DNA随机断裂到所需的片断大小，用单链DNA 核酸酶修平末端，并在DNA的平末端连接所需的标签来标记DNA片段。这些被标记的片段可用于各种应用，包括患者样本的宏基因组DNA的分析，比较基因组分析，全基因组测序， 单核苷酸多态性基因分型，原位杂交。本专利技术提供了一种有效的方法产生标记的随机断裂的DNA片段文库，适应各种不同的测序平台。本专利技术的一个优点是，它允许连接任何所需标记的DNA片段，使所产生标记的DNA片段，可以直接应用到不同的第二代测序平台，包括但不限于由Illumina，Life Technologies (ABI), Roche, HeIicosBiotechnoIogies, Pacific Biosciences 这些公司制造的仪器，同样也适用于其它厂商生产的测序仪。本专利技术的另一个优点是，本专利技术的方法可以很容易地提高通量，并由机器人进行自动化操作。专业术语“转座子末端”或“转座子末端序列”，是指由特定核苷酸序列组成的双链 DNA。它可以和转座酶形成一个在体外有转座功能的转座复合体。这对在体外进行转座反应时插入双链目的DNA是至关重要的。转座子末端为双链DNA序列，第一条链(可转移链) 可以与目的DNA的5’端共价连接，第二条链(非转移链)在转座过程中不与目的DNA直接本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1. 一种随机断裂并同时标记DNA片段的方法，其特征在于，包括以下步骤 1.转座酶、双链转座子及目标DNA混合后发生反应，就是在转座酶的催化作用下，双链的转座子末端序列随机插入目标DNA序列中，形成被转座子末端序列标记的DNA片段，这些片段从5 ’至3 ’，始于双链转座子末端序列，继而是9个碱基对的单链DNA序列，然后是双链目标DNA片段，9个碱基对的单链DNA序列和双链转座子末端； ii.去除标记在DNA两端的双链转座子末端序列，生成未标记的DNA片段。iii.在未标记的DNA片断上连接需要的DNA标签，产生一个有新的标签的DNA片段。2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，用单链DNA内切酶来去除标记在DNA两端的双链转座子末端序列。3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，用单链DNA外切酶来产生带平末端的双链DNA。4.如权利要求I所述的方法，其特征在于，用DNA聚合酶来产生可连接的DNA末端。5....

【专利技术属性】
技术研发人员：王焱，
申请(专利权)人：吴江汇杰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：