诱变方法技术

本发明专利技术提供了一种诱变方法，其中在引物延伸反应中用至少一种诱变引物诱变核酸分子，并随后通过滚环扩增（RCA）进行扩增。所述方法包括下述步骤：通过链置换DNA聚合酶，仅导致突变链的选择性扩增。在多次引发的RCA中产生突变的质粒的多个拷贝，并转化得到的DNA进行使用。所述方法适用于突变单链和双链DNA。本发明专利技术也提供了用于诱变方法中的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及和用于所述方法中的试剂盒。
技术介绍
大的随机化的基因文库对于现代蛋白工程而言是无价工具。已经为定点诱变开发了几种方法，它们的共同目标是，用尽可能容易且快速的方案获得大的、高质量的突变体文库。影响随机化的基因文库质量的主要因素是基因多样性的非故意偏倚、翻译区的DNA序列中的移码频率和在终产物中存在的野生型模板分子的量。在定点诱变技术中，通过重新基因装配，或通过使用野生型基因模板，将合成的适当地随机化的寡核苷酸掺入靶基因中。在主要用于研究实验室的后一选项中，通过在适度温度的引物延伸或基于PCR的方法(使用野生型基因作为模板)，掺入诱变寡物。 国际专利公开WO 2008/067035公开了一种称作无限制诱变和克隆(URMAC)的技术，其用于诱变大的线性的或环状的核酸。所述技术包含一系列2个PCR和3个连接步骤，并具有额外的任选的富集PCR反应。早期的引物延伸方法之一使用含有尿嘧啶的单链DNA (ss(U)DNA)模板。不需要表型选择，因为新生合成的突变体链不含有尿嘧啶，并因而在细菌繁殖中受到偏好，产生报道的50%诱变效率。随后已经如下改进该方法(称作Kunkel诱变)，以适用于ds (U) DNA模板通过碱性变性的模板DNA的额外硝酸纤维素过滤步骤，使用另一种寡物来破坏独特的限制性酶位点(用于模板序列去除)，和通过用DpnI消化剩余的未突变的甲基化的dS(U)DNA模板。但是，ds (U)DNA模板策略会危害制备具有更小文库尺寸的模板的容易性，因为使用dsDNA的引物延伸比ssDNA的效率更低。Kunkel诱变甚至已经成功地用于将几种诱变寡物同时掺入ss (U) DNA模板中。该策略要求，将模板DNA序列修饰成在诱变位点处含有终止密码子，以防止野生型蛋白的翻译，因为在终产物中的高比例的野生型模板是该方法的一个主要缺点。本领域需要有效的、低背景，尤其是用于建立大的随机化的基因文库，其中不需要模板修饰，且其导致可转化的DNA的充足供应，避开下述众所周知的问题即DNA向宿主细胞的转化是基因文库生产线中的最大瓶颈。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是，提供用于诱变核酸分子的新颖的装置和方法。具体地，本专利技术的一个目的是，提供用于以低模板背景有效地诱变单链和双链DNA并增加突变的DNA的产率的装置和方法。本专利技术提供了一种诱变核酸分子的方法。所述方法包括下述步骤a)提供模板，所述模板包含在环状DNA载体中的靶核酸分子，b)提供至少一种诱变引物，其含有要导入靶核酸分子中的突变，c)使所述诱变引物与靶核酸分子退火，d)进行引物延伸和连接反应，以形成双链的异源双链体，其中一条链是模板链，另一条链是新合成的突变链，e)使模板链不适于滚环扩增(rolling circle amplification, RCA), f)通过多次引发的滚环扩增来扩增突变链，和g)将扩增的且重新环化的DNA转化至合适的宿主中。在有些实施方案中，所述方法包括在步骤f)和g)之间的额外步骤，其中所述扩增的DNA被(i )消化、(ii )消化和连接或(iii )使用重组减小成质粒大小的单位。在有些实施方案中，步骤a)的模板含有尿嘧啶，且在步骤e)中，通过尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)处理，使所述模板链不适于RCA (the template strand is renderedunfavourable for the RCA)。在其它实施方案中，所述模板可以从ung-/dut_大肠杆菌株得到。在其它实施方案中，步骤a)的模板是甲基化的且尿苷酸化的(uridylated)dsDNA，在步骤e)中通过DpnI限制性酶和UDG处理使其不适于RCA。在其它实施方案中，所述模板可以从dam+Amg-/dut-大肠杆菌株得到。在其它实施方案中，步骤a)的模板含有甲基，且在步骤e)中，通过限制性酶处理 使所述模板链不适于RCA，所述限制性酶能够消化甲基化的DNA，但是不能消化未甲基化的DNA。在这样的实施方案中，所述限制性酶是Dpnl，和/或所述模板可以从dam+大肠杆菌株得到。在其它实施方案中，在有甲基化剂存在下进行步骤c)的引物延伸反应，且通过限制性酶处理使所述模板链不适于RCA，所述限制性酶能够使未甲基化的链产生切口，并使甲基化的链保持完整，诸如MspI和HaeIII。在这样的实施方案中，所述模板可以从dam-大肠杆菌株得到。在其它实施方案中，在步骤e)中，通过用仅在模板链中具有识别位点的产生切口的(nicking)内切核酸酶处理，使所述模板链不适于RCA。这样的实施方案可以另外包括在内切核酸酶处理以后，用外切核酸酶处理。本专利技术也提供了用于根据本专利技术的方法和所有它的实施方案中的试剂盒。所述试剂盒包括a)在适当的缓冲液中的第一种酶混合物，其包含用于引物延伸和连接的试剂，包括没有显著的链置换活性的DNA聚合酶、dNTP、DNA连接酶、ATP和DTT ；b)选择性的模板灭活酶；和c)在适当的缓冲液中的第二种酶混合物，其包含用于RCA的试剂，包括链置换DNA聚合酶诸如Phi29 DNA聚合酶、随机引物和dNTP。在有些实施方案中，所述试剂盒包括UDG作为所述选择性的模板灭活酶，并另外包括ung-/dut-大肠杆菌株。在其它实施方案中，所述试剂盒包括DpnI作为所述选择性的模板灭活酶。在其它实施方案中，所述选择性的模板灭活酶是能够使未甲基化的链产生切口，并使甲基化的链保持完整的限制性酶，诸如MspI或HaeIII，所述试剂盒另外包括dam-甲基化缺陷型菌株，诸如dam-大肠杆菌株。在其它实施方案中，所述选择性的模板灭活酶是能够使甲基化的链产生切口、同时使未甲基化的链保持完整的限制性酶，所述试剂盒另外包括能够dam-甲基化的菌株,诸如dam+大肠杆菌株。在其它实施方案中，所述选择性的模板灭活酶是产生切口的内切核酸酶。任选地，所述试剂盒可以另外包括至少一种选自下述的组分用于DNA的重新环化的T4 DNA连接酶、用于连接的DNA的DNA纯化柱和用于转化的感受态细胞。在随后的权利要求书中，阐述了本专利技术的方法和试剂盒的其它具体实施方案。从下述的附图、详细描述和实施例中，会明白本专利技术的其它目的、实施方案、方面、细节和优点。附图说明在下面，将参考附图借助于优选的实施方案更详细地描述本专利技术，在附图中 图I是本专利技术的的示意图，其中用尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)处理在传统的Kunkel诱变反应中产生的DNA异源双链体，通过滚环扩增进行扩增，随后消化并自连接，以形成突变的DNA的多个拷贝。图2解释了 UDG处理对ss⑶DNA诱变反应的影响，所述诱变反应使用由外切抗性的六聚体引发的选择性滚环扩增。饼形图解释了功能上突变的克隆(黑 色)相对于非功能上突变的和未突变的克隆(白色)的比例。图3解释了在用HindIII和SacII消化噬粒(phagemid)DNA样品的不同处理以后诱变的成功。成功的突变会破坏SacII限制位点，产生线性的5. 4 kb DNA片段，而未突变的DNA被消化成2个4. 5 kb和0. 9 kb DNA片段。(A)异源双链体-UDG，(B)异源双链体+ UDG，(C)异源双链体-UDG +RCA，(D)异源双链体+UDG + RCA，使用外切抗性的随本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.12.21 FI 200963711.一种诱变核酸分子的方法，所述方法包括下述步骤 a)提供模板，所述模板包含在环状DNA载体中的靶核酸分子， b)提供至少ー种诱变引物，其含有要导入靶核酸分子中的突变， c)使所述诱变引物与靶核酸分子退火， d)进行引物延伸和连接反应，以形成双链的异源双链体，其中一条链是模板链，另一条链是新合成的突变链， e)使模板链不适于滚环扩增(RCA)， f)通过多次引发的滚环扩增来扩增所述突变链，和 g)将扩增的DNA转化至合适的宿主中。2.根据权利要求I所述的方法，所述方法包括在步骤f)和g)之间的额外步骤，其中所述扩增的DNA通过下述方法转化成质粒大小的単位(i)用限制性酶消化，(ii)用限制性酶消化和用DNA连接酶连接，或(iii)通过重组。3.根据权利要求I所述的方法，其中步骤a)的模板含有尿嘧啶，且在步骤e)中，通过尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)处理，使所述模板链不适于RCA。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述模板是从ung-/dut-大肠杆菌株得到。5.根据权利要求I所述的方法，其中步骤a)的模板是甲基化的且尿苷酸化的dsDNA，在步骤e)中通过UDG和DpnI限制性酶处理使模板dsDNA不适于RCA。6.根据权利要求5所述的方法,其中所述模板是从dam+Amg-/dut-大肠杆菌株得至IJ。7.根据权利要求I所述的方法，其中步骤a)的模板含有甲基，且在步骤e)中，通过限制性酶处理使所述模板链不适于RCA，所述限制性酶能够消化甲基化的DNA，但是不能消化未甲基化的DNA。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述限制性酶是DpnI。9.根据权利要求7所述的方法，其中所述模板是从dam+大肠杆菌株得到。10.根据权利要求I所述的方法，其中在有甲基化剂存在下进行步骤d)的引物延伸反应，且在步骤e)中通过限制性酶处理使所述模板链不适于RCA，所述限制性酶能够使未甲基化的链产生切ロ，并使甲基化的链保持完整。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述限制性酶选自MspI和Haelll。12.根据权利要求10所述的方法，其中所述模板是从dam-大肠杆菌株得到。13.根据权利要求10-12中任一项所述的方法，所述方法另外包括在用限制性...

【专利技术属性】
技术研发人员：T霍维南，U拉明马基，EC布罗克曼，M维尼艾南，
申请(专利权)人：图尔库大学，
类型：发明
国别省市：