抗草铵膦紫花苜蓿植株的培养基和土壤筛选方法技术

本发明专利技术主要涉及抗草铵膦紫花苜蓿植株的筛选方法。具体涉及抗草铵膦种质筛选方法。一种抗草铵膦紫花苜蓿植株的培养基筛选方法，其主要特点在于包括如下步骤：(1)MS培养基萌发种子；(2)剂量筛选；(3)甲基磺酸乙酯半致死剂量诱变紫花苜蓿种子；(4)抗草铵膦紫花苜蓿植株筛选；(5)抗性植株再次筛选。本发明专利技术与现有技术相比，具有以下优点和效果：本发明专利技术简便易行，见效快捷，在短期内可以获得抗除草剂紫花苜蓿的单株。本发明专利技术采用的是诱变手段。利用化学诱变剂EMS诱变紫花苜蓿种子产生点突变，通过培养基和土壤筛选两种途径筛选抗除草剂紫花苜蓿单株，不但为常规育种提供了新的种质资源，对其他植物的抗除草剂选育也提供了一定的参考。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术主要涉及抗草铵膦紫花苜蓿植株的筛选方法。具体涉及抗草铵膦种质筛选方法。一种抗草铵膦紫花苜蓿植株的培养基筛选方法，其主要特点在于包括如下步骤：(1)MS培养基萌发种子；(2)剂量筛选；(3)甲基磺酸乙酯半致死剂量诱变紫花苜蓿种子；(4)抗草铵膦紫花苜蓿植株筛选；(5)抗性植株再次筛选。本专利技术与现有技术相比，具有以下优点和效果：本专利技术简便易行，见效快捷，在短期内可以获得抗除草剂紫花苜蓿的单株。本专利技术采用的是诱变手段。利用化学诱变剂EMS诱变紫花苜蓿种子产生点突变，通过培养基和土壤筛选两种途径筛选抗除草剂紫花苜蓿单株，不但为常规育种提供了新的种质资源，对其他植物的抗除草剂选育也提供了一定的参考。【专利说明】抗草铵滕紫花苜蓿植株的培养基和土壤筛选方法
本专利技术主要涉及抗草铵膦紫花苜蓿植株的筛选方法。具体涉及抗草铵膦种质筛选 方法。
技术介绍
紫花苜猜（Medicago sativa L.)具有优质、高产、饲用价值高（粗蛋白含量 21%)、适口性好、用途广泛等特点，被世界誉为"牧草之王"，有着很好的固氮、保肥、保持 水土的作用，具有食用价值，产业化发展前景良好。而苜蓿地杂草种类繁多，双子叶杂草和 单子叶杂草兼具，其中以双子叶杂草的危害最为严重。杂草与苜蓿争夺阳光、水分、养分和 空间，还会将病虫害传播给苜蓿，对苜蓿品质和产量造成了严重的不良影响，联合国粮农组 织近年来的统计数据表明，全世界每年由草害造成的作物减产率平均达9. 7%，减产值高达 204亿美元（张殿京和陈仁霖，1992)。人工除草成本又高，这为除草剂的研发开拓了市场， 草铵膦为灭生性除草剂，但灭生性除草剂在杀死杂草的同时也伤害了苜蓿，选育并发展抗 除草剂作物势在必行，这远比研制新型除草剂更加经济实惠，可节省20到100倍的成本，所 以获得抗草铵膦苜蓿品种显得尤为重要。 对除草剂抗性的研究，早期是直接从自然界中筛选抗除草剂作物，接着是采用传 统杂交育种手段将具有抗性的基因转入目标作物中，随后是细胞培养、突变等方法，当前获 取抗除草剂作物的技术主要分为转基因、非转基因两大类。在外源基因的不可预知性渐渐 变为转基因作物发展的阻碍时，非转基因抗除草剂作物的发展愈来愈受重视，诱变育种为 其中一种手段。目前，通过非转基因手段培育的抗除草剂作物有玉米、大豆、菜豆和烟草等 20余种，抗除草剂种类包括ALS类（如咪唑啉酮类、磺酰脲类）、ACCase类（如环己烯二酮 类）、草甘膦类、草铵膦类和合成生长素类等。然而目前鲜有抗除草剂牧草的相关报道。因 此，筛选抗草铵膦除草剂的紫花苜蓿对于我国牧草产业发展具有十分重要意义。然而，在本 专利技术申请之前，国内还没有公开或发表过抗草铵膦紫花苜蓿植株的筛选方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是避免现有技术的不足，提出一种抗草铵膦紫花苜蓿植株的培养基 筛选方法。 本专利技术的又一目的提出一种抗草铵膦紫花苜蓿植株的土壤筛选方法。 为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种抗草铵膦紫花苜蓿植株的培养 基筛选方法，其主要特点在于包括如下步骤： (1)MS培养基萌发种子 精选紫花苜蓿种子；配制MS培养基培养板备用；无菌条件下进行种子消毒： 60-100%酒精浸洗种子2-0.511^11 ;2%次氯酸钠溶液浸洗5-151^11;(1(1!120清洗种子3-10 次；铺板，用镊子将消过毒的种子均匀铺于MS培养基上，封口膜封口后置于人工培养箱， 22-18°C，0_18h光照，24-6h黑暗发芽；胚根突破种皮视为萌发，第3-6天，平均发芽率达到 50%以上，待用； (2)剂量筛选 草铵膦设置多个处理，浓度分别为〇mg/L至15mg/L，配置以上不同浓度的草铵膦 培养基，每个浓度3个重复，设与浓度相匹配的多个培养板； 无菌条件下，将MS培养基中发芽的健康种子转入不同浓度草铵膦培养基，封口膜 封口后置于22-18°C人工培养箱培养，于培养箱中培养18天，18天后统计致死率，筛选出用 于培养基筛选的草铵膦致死剂量为8mg/L ; (3)甲基磺酸乙酯半致死剂量诱变紫花苜蓿种子 紫花苜蓿种子用98 %浓硫酸处理3-10min先打破硬实，蒸馏水冲洗3-10次；种子 在磷酸缓冲液（l〇〇mM，PH7. 0)，于4°C下预浸种6-18h，用磷酸缓冲液配置浓度为0. 2-2. 0 % (v/v)的甲基磺酸乙酯（EMS)溶液，在室温黑暗条件下用EMS处理种子，处理时长12-24h， 置于低温摇床，120rpm/min，18-22°C不断摇晃，再用自来水冲洗2-5h以去除残留的EMS，每 25-35min放置10-20min ;之后铺于干净的滤纸上将种子晾干待用；挑选诱变后饱满完好的 紫花苜蓿种子，分装于离心管中；配制MS基本培养基培养板备用；在MS培养基萌发诱变后 的种子，封口膜封口后置于人工培养箱，22-18°C，0_18h光照，24-6h黑暗发芽； (4)抗草铵膦紫花苜蓿植株筛选 配置添加了致死剂量（8mg/L)草铵膦的MS培养基培养板备用；无菌条件下，将步 骤（3)中MS培养基萌发第3-6天的健康种子转入添加了致死剂量的草铵膦培养基中，封口 膜封口后置于18_22°C人工培养箱培养，于培养箱中培养10-20d，每天观察统计，10-20d后 筛选出抗性植株； 配置1/2MS培养基，将筛选出的存活植株转入1/2MS培养基中继续培养，每2-3天 更换一次1/2MS培养基，待存活株长出复叶移栽到花盆继续生长； (5)抗性植株再次筛选 将1/2MS培养基中长出一片复叶的幼苗移栽至土壤继续培养，待幼苗长至2-3叶 期开始用80mg/L的草铵膦溶液进行喷施，每隔4-8d喷一次，喷施2次。 一种抗草铵膦紫花苜蓿植株的土壤筛选方法，其主要特点在于包括如下步骤： (1) 土壤萌发种子 将挑选出的健康饱满的紫花苜蓿种子播种于花盆，盆栽土壤为草炭土与蛭石1:1 比例混合，pH为8. 7,植物生长室培养，25-15°C，14-18h光照，10-6h黑暗；每盆均匀撒播种 子，覆土厚度约〇. 5-2cm，浇水200-500mL后用保鲜膜覆盖，保鲜膜覆盖生长2-5天，出苗后 揭掉保鲜膜； (2)剂量筛选 草铵膦设置多个处理，浓度分别为Omg/L至120mg/L，配置以上不同浓度的草铵膦 溶液装于喷壶；每个浓度多个重复； 待幼苗长至第一复叶期，在生长至第14-16天时，开始喷施除草剂；每隔4-8天喷 施1次，连续12-24d，喷施3次；喷施除草剂时一来一回扫过叶面算作一次，保证除草剂均 匀撒施到叶面上，第3次喷施后的第7天统计致死率，筛选出用于土壤筛选的草铵膦致死剂 量为 80mg/L ; (3)甲基磺酸乙酯半致死剂量诱变紫花苜蓿种子 紫花苜蓿种子用98 %浓硫酸处理3-10min先打破硬实，蒸馏水冲洗3-10次； 种子在磷酸缓冲液中，l〇〇mM，PH7. 0,于4°C下预浸种6-18h，用磷酸缓冲液配置浓度为 0. 2-2.0% (v/v)的甲基磺酸乙酯（EMS)溶液，在室温黑暗条件下用EMS处理种子，处理时 长12-24h，置于低温摇床，12本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗草铵膦紫花苜蓿植株的培养基筛选方法，其特征在于包括如下步骤：(1)MS培养基萌发种子精选紫花苜蓿种子；配制MS培养基培养板备用；无菌条件下进行种子消毒：60‑100％酒精浸洗种子2‑0.5min；2％次氯酸钠溶液浸洗5‑15min；ddH2O清洗种子3‑10次；铺板，用镊子将消过毒的种子均匀铺于MS培养基上，封口膜封口后置于人工培养箱，22‑18℃，0‑18h光照，24‑6h黑暗发芽；胚根突破种皮视为萌发，第3‑6天，平均发芽率达到50％以上，待用；(2)剂量筛选草铵膦设置多个处理，浓度分别为0mg/L至15mg/L，配置以上不同浓度的草铵膦培养基，每个浓度多个重复，设与浓度相匹配的多个培养板；无菌条件下，将MS培养基中发芽的健康种子转入不同浓度草铵膦培养基，封口膜封口后置于18‑22℃人工培养箱培养，于培养箱中培养18天，18天后统计致死率，筛选出用于培养基筛选的草铵膦致死剂量为8mg/L；(3)甲基磺酸乙酯半致死剂量诱变紫花苜蓿种子紫花苜蓿种子用98％浓硫酸处理3‑10min先打破硬实，蒸馏水冲洗3‑10次；种子在100mM，pH7.0的磷酸缓冲液中，于4℃下预浸种6‑18h，用磷酸缓冲液配置浓度为0.2‑2.0％(v/v)的甲基磺酸乙酯溶液，在室温黑暗条件下用甲基磺酸乙酯处理种子，处理时长12‑24h，置于低温摇床，120rpm/min，18‑22℃不断摇晃，再用自来水冲洗2‑5h以去除残留的甲基磺酸乙酯，每25‑35min放置10‑20min；之后铺于干净的滤纸上将种子晾干待用；挑选诱变后饱满完好的种子，分装于离心管中；配制MS基本培养基培养板备用；在MS培养基萌发诱变后的种子，封口膜封口后置于人工培养箱，22‑18℃，0‑18h光照，24‑6h黑暗发芽；(4)抗草铵膦紫花苜蓿植株筛选配置添加了致死剂量8mg/L草铵膦的MS培养基培养板备用；无菌条件下，将步骤(3)中MS培养基萌发第3‑6天的健康种子转入添加了致死剂量的草铵膦培养基中，封口膜封口后置于22‑18℃人工培养箱培养，于培养箱中培养10‑20d，每天观察统计，10‑20d后筛选出抗性植株；配置1/2MS培养基，将筛选出的存活植株转入1/2MS培养基中继续培养，每2‑3天更换一次1/2MS培养基，待存活株长出复叶移栽到花盆继续生长；(5)抗性植株再次筛选将1/2MS培养基中长出一片复叶的幼苗移栽至土壤继续培养，待幼苗长至2‑3叶期开始用80mg/L的草铵膦溶液进行喷施，每隔4‑8d喷一次，喷施2次。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张吉宇，霍雅馨，段珍，狄红艳，骆凯，吴凡，
申请(专利权)人：兰州大学，
类型：发明
国别省市：甘肃;62