本发明专利技术提供一种提高黄芩毛状根黄芩苷产量的方法，主要是采用低能离子束注入技术对黄芩毛状根进行处理，并将处理后的黄芩毛状根作为种子，利用三级培养法进行扩大培养，运用高效液相色谱法测定其黄芩苷含量，结果表明经低能离子诱变的毛状根相比于对照组，具有生长速度快、生物合成黄芩苷能力强、遗传稳定等优点，黄芩毛状根生长至45天，其毛状根生物量及其黄芩苷含量分别达到16.57g/L和28.3%，与未经低能离子注入的黄芩毛状根生物量及其黄芩苷含量13.28g/L和21.01%相比，分别提高了24.77%和35.03%。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供，主要是采用低能离子束注入技术对黄芩毛状根进行处理，并将处理后的黄芩毛状根作为种子，利用三级培养法进行扩大培养，运用高效液相色谱法测定其黄芩苷含量，结果表明经低能离子诱变的毛状根相比于对照组，具有生长速度快、生物合成黄芩苷能力强、遗传稳定等优点，黄芩毛状根生长至45天，其毛状根生物量及其黄芩苷含量分别达到16.57g/L和28.3%，与未经低能离子注入的黄芩毛状根生物量及其黄芩苷含量13.28g/L和21.01%相比，分别提高了24.77%和35.03%。【专利说明】
本专利技术属于植物组织培养
，具体涉及。
技术介绍
黄芩是常用药材品种，具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎等功效。其主要有效成分黄芩苷和黄芩素具有显著的解热、抑菌、镇静、降压等作用，因此以黄芩为原料的中药有效成分提取厂家纷纷崛起，加之各种黄芩成药产品的广泛开发，特别是双黄连、银黄系列，黄芩的年销量急剧增加。加上近年来国家出台了一系列保护野生资源的政策，致使可用野生黄芩资源日渐萎缩，而家种黄芩的种植面积也因价格和经济利益的因素得不到明显的扩大，并且家种黄芩存在药残风险。这些因素导致了黄芩药材出现紧缺、供不应求的现状。因此，亟需开发出一条新的、行之有效的黄芩药材及有效成分药源新途径。而在众多的应对措施中，黄芩毛状根的培养及有效成分积累和代谢调控越来越受到人们的关注，并且其在生产周期、有效成分积累和农药激素残留等方面显示出了独特的优势。上世纪80年代以后，随着植物生物技术的发展，有关毛状根的研究十分迅速，除了探求外源基因导入植物细胞的机制和植物激素的生理效应外，应用毛状根生物技术诱导植物次生代谢产物的形成与生物转化等研究也有很大发展，这一生物技术为植物有效成分的大量生产提供了新的途径，越来越引起人们的重视。到20世纪末，国内外学者已建立了分属于31个科的100余种植物的毛状根培养体系，并进行次级代谢产物的生产和调控，包括苷类、生物碱、醌类、芳香油、酚类、黄酮等多种天然产物。毛状根培养技术已被认为是生产药用植物次生代谢产物的一条重要途径，具有非常广泛的应用前景。Nishikawa等将发根农杆菌ATCC15834含有 的Ri质粒中的T-DNA片段整合到黄芩愈伤组织，诱导出毛状根，进行黄芩的毛状根培养，从而提高黄芩的次生代谢产物的产量。而国内对黄芩毛状根的培养研究工作开展的相对较晚。2006年，齐香君等利用激素诱导黄芩无菌苗外植体(带节茎段)，并通过发根农杆菌(1.2556、A49615和A4野生型)诱导得到黄芩毛状根，经过培养条件优化采用2L鼓泡式反应器对黄芩毛状根的扩大培养做了初步的尝试，发现毛状根生长量为14.9g/L，黄芩苷含量为5.16%、产量为0.77g/L，其生长量略高于摇瓶培养，黄芩苷含量偏低。2009年李雅等建立了三级黄芩毛状根的培养体系，毛状根的生物量为11.52g/L，黄芩苷含量为20.99%。目前，已有少数单位正在利用低能离子束生物技术对药用植物育种工作展开研究，并已取得明显成效，新疆大学离子束生物工程实验室对低能离子注入麻黄种子生物效应进行了初步研究，结果表明:离子注入对麻黄种子的生长起良好的生物效应；内蒙古大学离子束生物工程重点实验室正开展以药用植物为对象，用离子束生物技术进行品种改良的系列研究。但是目前，尚没有关于将离子束用于毛状根品质改良的研究报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供。为达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案:I)黄芩毛状根预培养将黄芩毛状根以5~10g/L的接种量接种于改良的MS液体培养基中，然后于25~28°C避光培养4~6天，所述改良的MS液体培养基为添加有0.4~0.6mmol/L苯丙氨酸以及60~70g/L蔗糖的MS液体培养基；2)毛状根的处理将150~200mg经过预培养的黄芩毛状根在无菌条件下剪切成1.5~2cm的毛状根片段，将毛状根片段放置于无菌的培养皿中，然后用无菌风将培养皿中的毛状根片段吹干，然后将培养皿放入离子注入机靶室中对毛状根片段进行低能离子束注入；3)以经过低能离子束注入后的毛状根片段为黄芩毛状根种子，对黄芩毛状根种子进行扩大培养。所述低能离子束注入的条件为:注入离子为N+，注入剂量为2.5X IO16~3.5X1016ions/cm2，注入能量为15~25KeV，脉冲时间为5~10s，间隔时间为5~10s。所述扩大培养具体包括以下步骤:I)种子培养 种子培养包括一级种子培养和二级种子培养，一级种子培养是指将50~60mg经过低能离子束注入后的毛状根片段接种于100~200mL所述改良的MS液体培养基中，然后在100~200r/min、25~28°C条件下避光培养5~10天获得毛状根A，二级种子培养是指将150~200mg毛状根A接种于300~500mL所述改良的MS液体培养基中，然后在100~200r/min、25~28°C条件下避光培养10~15天获得毛状根B ；2)培养基二次补加培养将毛状根B以5~10g/L的接种量接种于500~1000mL所述改良的MS液体培养基中，然后在100~200r/min、25~28°C下避光培养，培养到10~20天补加300~500mL所述改良的MS液体培养基，然后继续在100~200r/min、25~28°C下避光培养10~20天后收获毛状根。本专利技术的有益效果体现在:本专利技术运用低能离子注入技术处理黄芩毛状根，显著提高了黄芩毛状根培养中黄芩毛状根的黄芩苷含量，具有操作简单、稳定、高效等优点。进一步的，本专利技术将低能离子束注入处理后的黄芩毛状根作为种子，采用三级黄芩毛状根培养技术(一级种子培养、二级种子培养以及培养基二次补加培养)进行培养，黄芩毛状根中黄芩苷的含量可提高到28.3%。【专利附图】【附图说明】图1为经低能离子注入的黄芩毛状根和对照组的生长曲线图谱；图2为低能离子注入的黄芩毛状根生物合成黄芩苷的遗传稳定性图谱。【具体实施方式】下面结合附图和实施例对本专利技术作详细说明。本专利技术利用低能N+注入新鲜的黄芩毛状根，并将其作为种子，进行三级黄芩毛状根培养，具体步骤如下:I)预培养:将本实验室已有的黄岑属黄岑(Scutellaria baicalensis Georgi)的毛状根(获取方法依据ZL201110132376.4)在无菌条件下以5g/L的接种量接种于IOOmL改良的MS液体培养基中，然后于26 °C避光培养6天，所述改良的MS液体培养基为在MS液体培养基(Murashige T and Skoog F (1962).Physiol Plantl5 (3): 473-497.)中添加 0.4mmol/L苯丙氨酸以及60g/L鹿糖；2)经过步骤I)后，在无菌操作台上称取150mg经过上述预培养的毛状根并剪切成1.5cm的毛状根片段，将毛状根片段均匀放置于无菌的培养皿(90mm)中并用无菌风吹35min，使毛状根片段表面干燥。然后将所述培养皿放置于离子注入机靶室内并对培养皿内的毛状根片段进行低能离子束注入，低能离子束注入的条件为:注入离子为N+，注入剂量为3.0X1016ions/cm2，注入能量为20KeV，脉冲时间为5s，间隔时间为10s。3)以经过低能离子束注入后的毛状根片段为黄芩本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种提高黄芩毛状根黄芩苷产量的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）黄芩毛状根预培养将黄芩毛状根以5～10g/L的接种量接种于改良的MS液体培养基中，然后于25～28℃避光培养4～6天，所述改良的MS液体培养基为添加有0.4～0.6mmol/L苯丙氨酸以及60～70g/L蔗糖的MS液体培养基；2）毛状根的处理将150～200mg经过预培养的黄芩毛状根在无菌条件下剪切成1.5～2cm的毛状根片段，将毛状根片段放置于无菌的培养皿中，然后用无菌风将培养皿中的毛状根片段吹干，然后将培养皿放入离子注入机靶室中对毛状根片段进行低能离子束注入；3）以经过低能离子束注入后的毛状根片段为黄芩毛状根种子，对黄芩毛状根种子进行扩大培养。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：钱卫东，付云芳，施春阳，蔡长龙，齐香君，
申请(专利权)人：陕西科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61
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