本发明专利技术公开了一种化学诱变酿酒酵母基因工程菌提高重组质粒稳定性的方法，包括如下步骤：1）化学诱变；2）筛选；3）PCR检测质粒稳定性；4）诱导表达与活性检测。本发明专利技术通过化学诱变剂硫酸二乙酯诱变酿酒酵母基因工程菌株，用含有五氟尿嘧啶的培养基筛选，致死淘汰能利用培养基中尿嘧啶的细胞，得到不能利用培养基中尿嘧啶的突变体。该突变体只能或基本只能使用质粒本身基因合成尿嘧啶，因而在非选择培养基中仍然维持质粒稳定性，极大降低了培养基成本，克服了制约利用酿酒酵母基因工程菌大规模生产抗菌肽的关键难题之一。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了，包括如下步骤：1）化学诱变；2）筛选；3）PCR检测质粒稳定性；4）诱导表达与活性检测。本专利技术通过化学诱变剂硫酸二乙酯诱变酿酒酵母基因工程菌株，用含有五氟尿嘧啶的培养基筛选，致死淘汰能利用培养基中尿嘧啶的细胞，得到不能利用培养基中尿嘧啶的突变体。该突变体只能或基本只能使用质粒本身基因合成尿嘧啶，因而在非选择培养基中仍然维持质粒稳定性，极大降低了培养基成本，克服了制约利用酿酒酵母基因工程菌大规模生产抗菌肽的关键难题之一。【专利说明】
本专利技术属于生物工程
，具体涉及 。
技术介绍
抗菌肽是在诱导条件下，生物体免疫防卫系统产生的小分子活性肽类，广泛分布于植物，动物以及人类。抗菌肽是由基因编码、由核糖体合成的。目前已经发现、鉴定的抗菌肽已超过千种，大多带净正电荷。从结构上看可以分为α-螺旋型、折叠型、富含二硫键的、富含脯氨酸等多种类型。抗菌肽抑菌谱广，有些抗菌肽还可以特异性地抑制某些肿瘤细胞的生长。抗菌肽可以用于医药卫生、食品添加剂、饲料添加剂等方面。抗菌肽与传统抗生素抑菌机理不同，抗菌肽的作用方式主要是选择性地攻击病原物的细胞膜，病原物不易产生针对抗菌肽的耐药性，因此使用抗菌肽可以解决细菌耐药性问题。同时又由于它是一种肽，可以被消化道消化、吸收对人体无害，无残留，因此，抗菌肽在医药、畜牧业、农业等方面都有十分广泛的应用前景。抗菌肽在生物体内含量极低，生产成本居高不下，严重影响其广泛应用；研究开发其大规模生产方法具有十分积极的意义。目前，生产抗菌肽的方法主要有三种:1.直接从生物体中提取天然抗菌肽:抗菌肽广泛存在于低等到高等动物的特定组织中，但是含量非常少，且提取工艺复杂，成本昂贵，难以满足大规模生产的要求；2.化学方法合成抗菌肽:化学合成法成本高，同时难以保证合成肽类的天然结构和生物活性；3基因工程方法:采用该方法是如今研究的热点，也是获得抗菌肽的有效途径之一。酿酒酵母在食品业使用有数千年的历史，也是基因工程的模式生物之一。随着DNA重组技术的发展，酿酒酵母已被广泛地应用于外源蛋白表达的宿主，其是真核生物，无内毒素，长久以来在食品和酿酒工业中广泛应用；胞外分泌表达蛋白，简化了表达产物的分离纯化。基因工程中酿酒酵母载体有两类:整合型载体(YIps)和附加体型载(YEps)。整合型载体不含自主复制序列，通过同源重组被整合到宿主酵母菌的染色体上，稳定性好，但拷贝数很低，不能满足生产要求。附加体型载体一般利用酵母天然2μ质粒的复制原点序列，能够独立于酵母染色体外自主复制，拷贝数通常可达30以上，易于更换宿主菌，但附加体型载体在非选择条件下不稳定，大规模发酵时更容易丢失，而重组质粒在宿主细胞中的稳定存在，是基因工程生产异源蛋白的前提。当利用质粒载体在大量高效表达某种特殊产物时，质粒载体的丢失就意味着产量的下降，对于外源基因的表达是很大的障碍。从而给生产带来严重的后果。如何有效提高质粒稳定性，一直是一个亟待解决的既有理论意义又有实际应用价值的关键问题。pYES2是应用较为广泛的酿酒酵母白表达载体，其在宿主细胞中稳定的机制，是通过质粒本身所携带的URA3基因弥补INVScl宿主细胞尿嘧啶营养缺陷，转化菌在不含尿嘧啶的选择性培养基中培养以保持选择压力，即可维持质粒的稳定存在。但选择性培养基为合成培养基，要求添加一些氨基酸以及无碱基氮源，成本很高，构成工业化生产的主要障碍之一 。URA3编码乳清酸核苷-5' _磷酸脱羧酶，催化乳清甘酸脱羧形成尿嘧啶核苷酸，其它嘧啶核苷酸由尿嘧啶核苷酸转变得到。若细胞乳清酸核苷-5^ -磷酸脱羧酶活性缺失，则需要利用培养基中的尿嘧啶，通过补救途径合成尿嘧啶核苷酸，与此有关的酶有尿嘧啶透性酶、尿苷磷酸化酶等。鉴于构建好的基因工程菌株可以利用重组PYES2质粒的URA3基因合+突变体，使其失去或减弱从培养基中获取尿嘧啶的能力，这样基因工程菌可以在完全培养基中生长，同时保持对质粒稳定性所必需的选择压力。。诱变是通过物理、化学、生物因素作用于宿主菌，人为使其遗传物质发生变异的手段，不仅可以提高菌种有效产物的产量，改善其生物学特性和创造新品种，而且对于研究有效产物代谢途径、遗传图谱绘制、功能基因分析等都具有一定的作用。诱变育种操作简便、速度快、收效大、手段多样，所以是实验室及生产上最为常用的高产菌株育种方式。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供。本专利技术所采取的技术方案是: ，包括如下步骤: 1)化学诱变 2)筛选; 3)PCR检测质粒稳定性。步骤I)所述诱变的操作为:取含重组质粒的酿酒酵母基因工程菌悬浮液加入诱变剂DES，超声波处理后，将诱变液加入硫代硫酸钠溶液中终止反应。作为优选的，步骤I)的具体操作为:取含重组质粒pYES2_ a -G13的酿酒酵母基因工程菌悬浮液加入诱变剂DES使其终浓度为2% (ν/ν)，超声波处理10~20min后，将诱变液加入25%的硫代硫酸钠溶液中终止反应。步骤2)所用的筛选剂为五氟尿嘧啶，具体操作为，将步骤I)诱变后的菌液涂布于含五氟尿嘧啶的SC-U固体培养基上进行筛选。作为优选的，所述SC-U固体培养基中五氟尿嘧啶的浓度为20 μ mol/L。步骤3)的具体操作为:于筛选板上挑选单个菌落接种于完全培养基培养，分别在培养24h、48h、72h、96h、120h、144h时做菌液PCR反应，检测质粒的稳定性。所述酿酒酵母基因工程菌为含有抗菌肽G13重组质粒pYES2- a -G13的酿酒酵母基因工程菌。本专利技术的有益效果在于: 本专利技术通过化学诱变剂硫酸二乙酯诱变酿酒酵母基因工程菌株，用含有五氟尿嘧啶的培养基筛选，致死淘汰能利用培养基中尿嘧啶的细胞，得到不能利用培养基中尿嘧啶的突变体。该突变体只能或基本只能使用质粒本身基因合成尿嘧啶，因而在非选择培养基中仍然维持质粒稳定性，极大降低了培养基成本，克服了制约利用酿酒酵母基因工程菌大规模生产抗菌肽的关键难题之一。对于本专利技术来说，主要解决了如下问题。1.诱变菌株在没有选择压力的完全培养基上可以正常生长而质粒不丢失，节约了培养基成本； 2.诱变菌株利用α信号肽，将表达产物分泌至胞外，避免了破碎细胞等工序，方便分离纯化，降低生产成本。【专利附图】【附图说明】图1为突变菌株在含有尿嘧啶的完全培养基上培养6天的PCR检测结果，其中S代表在尿嘧啶缺陷培养基上培养6天菌液的PCR结果，W代表在完全培养基上培养6天的菌液 PCR 结果，M 代表 DNA Marker D (2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、IOObp); 图2为诱变工程菌诱导上清对大肠杆菌DH5a和枯草芽孢杆菌活性检测图，其中A为枯草芽孢杆菌抑菌活性图，B为大肠杆菌DH5 α抑菌活性图，图中丨为氨苄，2为SC-U尿嘧啶缺陷培养基诱导上清，3为完全培养基诱导上清，4为无菌ddH20 ； 图3为PCR检测效果图。M为Maker，1-5是诱变菌株的在完全培养基第一到第五天的PCR检测，6-10是未诱变的完全培养基第一到第五天的PCR检测。【具体实施方式】下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明，但并不局限于此。实施例1 本实施例所用的酿酒酵母基因工程菌为含有重组质粒pYES2-a -G本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种化学诱变酿酒酵母基因工程菌提高重组质粒稳定性的方法，包括如下步骤：1）化学诱变；2）筛选；3）PCR检测质粒稳定性；4）诱导表达与活性检测。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：查向东，马利娟，赵大伟，余忠丽，车媛媛，徐雪娇，
申请(专利权)人：贵州省福泉市福中福农牧有限公司，
类型：发明
国别省市：
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