本发明专利技术公开了一种用于混凝土裂缝自修复的矿化微生物的筛选方法，包括以下步骤：对菌株进行活化及培养，制成细胞悬浮液；对细胞悬浮液进行紫外诱变后加入碱性培养基中进行培养；将获得的培养液稀释成不同的浓度后在不同的平板上分别进行培养；随机挑取复数个单菌落分别保存于装有固体培养基的微孔板的孔中倒置培养；将微孔板中的菌落接种于装有发酵培养基的深孔板对应的孔中静置培养；将深孔板放置于深孔板离心机中分离出上清液作为待测样品；测定样品中的钙离子浓度和钙矿化率，筛选出优良菌株。本发明专利技术的筛选方法具有微量化、小型化和平行化的特点，可以同时处理大量样品，节省人力、物力及时间，大幅提高筛选效率。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了，包括以下步骤：对菌株进行活化及培养，制成细胞悬浮液；对细胞悬浮液进行紫外诱变后加入碱性培养基中进行培养；将获得的培养液稀释成不同的浓度后在不同的平板上分别进行培养；随机挑取复数个单菌落分别保存于装有固体培养基的微孔板的孔中倒置培养；将微孔板中的菌落接种于装有发酵培养基的深孔板对应的孔中静置培养；将深孔板放置于深孔板离心机中分离出上清液作为待测样品；测定样品中的钙离子浓度和钙矿化率，筛选出优良菌株。本专利技术的筛选方法具有微量化、小型化和平行化的特点，可以同时处理大量样品，节省人力、物力及时间，大幅提高筛选效率。【专利说明】本专利技术涉及微生物育种，尤其涉及。混凝土结构的开裂不仅危害建筑材料的完整性，导致承载力和耐久性降低，而且可能导致重大安全事故和人员伤亡。目前，混凝土裂缝的检查和修复主要依赖人工操作，这种方法不仅成效有限而且耗资巨大，相比之下，混凝土自修复是一种更具可持续性和相对低成本的修复方法，近年来成为土木工程领域的研究热点。混凝土自修复又分为物理自修复、化学自修复和微生物自修复。其中微生物自修复是指掺入混凝土中的矿化微生物在裂缝形成后诱导矿化沉积作用产生碳酸钙以达到自动修复裂缝的目的。相对于传统修复加固材料，微生物矿化沉积材料反应条件温和、负面效应弱且相容性好，不会对结构及环境造成不可逆反应，对生态平衡有积极作用。具有碳酸钙沉积活性的菌株几乎涵盖了各个微生物类群，用于混凝土自修复的微生物主要是芽孢杆菌属的某些种类，其中，厌氧菌如巴氏芽孢杆菌主要利用脲酶作用分解尿素产生二氧化碳，而好氧菌如科氏芽孢杆菌、假坚强芽孢杆菌等主要利用呼吸作用产生二氧化碳，二氧化碳在高碱环境下迅速转化为碳酸根，达到一定浓度后与钙离子反应形成碳酸钙，晶体逐渐长大，直到堵塞裂缝。然而，这些菌株在自修复混凝土实际应用中的效果却差强人意，其主要原因在于微生物对混凝土内高碱环境的适应能力和碳酸钙沉积活性的双重不足。高效矿化菌种是混凝土微生物自修复的基础。在建立简便准确的菌株活性评价方法的基础上从自然界筛选或对现有菌株进行遗传物质改造一直是获得优良菌种的重要途径。传统矿化微生物筛选方法一般以250ml三角瓶作为发酵容器，每瓶装培养液50ml，每个样品需要3-4ml显色液；传统方法以单通道移液器进行接种取样稀释等操作；传统方法以分光光度计作为检测仪器，每个样品需要50 μ L左右发酵液，3000 μ L显色应用液，每I个样品的检测需要IOs左右；因此，常规的筛选方法工作量大、效率低而且成本高昂。本专利技术要解决的技术问题是提供一种工作量小、效率高而且成本低廉的用于混凝土裂缝自修复的矿化微生物的筛选方法。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是，，包括以下步骤:101)对菌株进行活化及培养，制成细胞悬浮液；102)对细胞悬浮液进行紫外诱变后加入碱性培养基中进行培养；103)将步骤102中获得的培养液稀释成不同的浓度后在不同的平板上分别进行培养；随机挑取复数个单菌落分别保存于装有固体培养基的微孔板的孔中倒置培养；104)将微孔板中的菌落接种于装有发酵培养基的深孔板对应的孔中静置培养；105)将深孔板放置于深孔板离心机中分离出上清液作为待测样品；106)测定样品中的钙离子浓度和钙矿化率，筛选出优良菌株。以上所述的筛选方法，步骤101包括将菌株在琼脂平板上划线活化，28°C -32°C培养20-28小时，取单菌落点接种于新的琼脂平板，28°C _32°C培养10_14h后用90_110mM的碳酸钠缓冲液洗下菌苔制成细胞悬液。以上所述的筛选方法，步骤102包括将细胞悬浮液和磁力搅拌器的转子置于培养皿中，将培养皿置于磁力搅拌器上，开动磁力搅拌器，用紫外灯照射10-20min后,将细胞悬液加入到碱性培养基中培养5-6h ;步骤103包括将培养液的浓度按一定的梯度稀释，将定量的不同浓度的稀释液涂布于碱性琼脂平板，每个梯度涂布复数个平板，28°C _32°C培养2-4天，挑取复数个单菌落，保存于装有碱性固体培养基的微孔板的孔中，28°C _32°C、倒置培养 24-48h。以上所述的筛选方法，步骤104包括将微孔板中的菌落用多通道移液器对应的接种于装有发酵培养基的深孔板I对应的孔中，于28°c -32°c静置培养36-60h ;将深孔板I中的发酵液对应地接种到装有发酵培养基的深孔板II对应的孔中，于28°C -32°C静置培养6-8天；将深孔板II放置于深孔板离心机中离心得到的上清液即为待测样品。以上所述的筛选方法，步骤105包括以微量化稀释法将待测样品稀释3-5倍，在透明微孔板中加入钙离子显色应用液，加入待测样品混匀，避光反应5-15min;反应结束后，采用酶标仪测定显色反应液的吸光度，根据标准曲线和待测样品稀释倍数计算待测样品中钙离子浓度和钙矿化率。以上所述的筛选方法，碱性培养基的组分和制备方法如下，酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，碳酸钠10g/L ;按以上浓度称量酵母粉和胰蛋白胨溶解于900ml水中，称量碳酸钠溶解于100ml水中，两种溶液灭菌后混匀；碱性固体培养基的组分和制备方法如下:酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，碳酸钠10g/L，琼脂粉15g ;按以上浓度称量酵母粉、胰蛋白胨和琼脂粉溶解于900ml水中；称量碳酸钠溶解于100ml水中,两种溶液灭菌后混匀。以上所述的筛选方法，发酵培养基的组分和制备方法如下:L_乳酸钠5-10g/L,硝酸钠 l_2g/L，酵母粉 0.5-2g/L，磷酸二氢钾 0.01-0.02g/L,氯化镁 0.05—0.lg/L,CAPSl 1-22.13g/L，氯化钠 5_30g/L，硫酸钠 3_4g/L，氯化钾 0.677g/L，溴化钾 0.05-0.15g/L,硼酸 0.02-0.03g/L,氟化钠 0.002-0.003g/L,氯化钙 1-1.3g/L，氯化锶 0.01-0.02g/L,去离子水IL ;按照以上浓度称量氯化钙、氯化锶和氯化镁溶解于180-220ml水中；称量CAPS溶解于130-170ml水中，用氢氧化钠溶液将CAPS溶液的pH值调整至9.6-10.5 ;其他组分溶解于630-670ml水中；上述3种溶液115_121°C灭菌15_30min后混匀。以上所述的筛选方法，将`钙原子光谱分析标准浓缩液用去离子水配制梯度浓度钙离子溶液用多通道移液枪吸取定量的各浓度钙离子溶液加入透明微孔板中，每个浓度加3个孔，用多通道移液枪向加有梯度浓度钙离子溶液的孔中加入定量钙离子显色应用液混匀，避光反应5-15min ;反应结束后，采用酶标仪测定显色反应液的在575nm的吸光度，以钙离子浓度为X坐标，光吸收值为Y坐标，得到标准曲线。以上所述的筛选方法，钙离子显色应用液由显色剂与缓冲液等体积混合配制，其中，显色剂的配制方法如下:500mg8-羟基喹啉中溶解于5000 μ L的浓盐酸中，加入邻-甲酚酞络合酮25mg完全溶解后，再加ImL聚乙二醇辛基苯基醚混匀，然后加去离子水至500ml ;缓冲液为浓度89.14g/L的AMP水溶液。以上所述的筛选方法，所述的菌株是DSM8715。本专利技术用于混凝土裂缝自修复的矿化微生物的筛选方法具有微量化、小型化和平行化的特点，可以同时处理大量样品，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于混凝土裂缝自修复的矿化微生物的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：101）对菌株进行活化及培养，制成细胞悬浮液；102）对细胞悬浮液进行紫外诱变后加入碱性培养基中进行培养；103）将步骤102中获得的培养液稀释成不同的浓度后在不同的平板上分别进行培养；随机挑取复数个单菌落分别保存于装有固体培养基的微孔板的孔中倒置培养；104）将微孔板中的菌落接种于装有发酵培养基的深孔板对应的孔中静置培养；105）将深孔板放置于深孔板离心机中分离出上清液作为待测样品；106）测定样品中的钙离子浓度和钙矿化率，筛选出优良菌株。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张金龙，邢锋，邓旭，韩宁旭，陆燕，廖云静，庾添玉，卢靖坤，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：
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