基于凝胶的核酸等温扩增试剂的保存方法技术

本发明专利技术涉及一种基于凝胶的核酸等温扩增试剂的保存方法，是将一种或几种核酸等温扩增反应液的组分包埋在凝胶内进行保存；所述凝胶的熔点低于用于核酸等温扩增的聚合酶的灭活温度。本发明专利技术方法处理后的等温扩增反应试剂混合物，可常温贮存和运输，使用时无需特殊处理，直接使用即可。由于处理后的等温扩增反应试剂混合物呈固态状，可以很方便的进行航空运输，解决了此前反应试剂混合物呈液态较难利用航空方式进行长距离运输的难题。本发明专利技术必将有力促进等温扩增技术的在科研、医疗、检验和检疫等领域的运用和基于等温扩增技术的诊断或检测试剂产品的大规模推广应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物试剂保存
，具体涉及ー种生化试剂组合物的保存方法，确切地说是分子生物学中核酸等温扩增反应试剂及试剂混合物的常温保存方法。
技术介绍
在过去的20年里，以多聚酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)为代表的核酸扩增技术得到了迅猛的发展和应用。最近几年，产生了一系列新型的核酸等温扩增技木，这些技术或基于DNA/RNA生物合成机制研究的新发现，或者利用具有特殊功能的核酸酶来实现恒温条件下对目标核酸的扩增；无论在实际操作还是在仪器要求方面，这些等温扩增技术都比PCR技术更简单和廉价，从而更容易被开发和利用；尤其是在核酸检测及诊断领域，等温扩增技术正逐渐成为PCR技术的替代方法而被广泛应用。利用等温扩增技术开发的各类检测及诊断产品在特异性、易用性、成本和方便性等方面具有PCR技术产品无可比拟的优势，市场前景极为广阔。虽然等温扩增技木本身优势明显，但基于等温扩增技术的产品在大規模应用过程中却面临ー些问题的困扰。其中最为突出的是产品需要低温冷冻保存和运输。作为核酸扩增技术的ー种，等温扩增也需要由具有生物活性的酶的參与，而酶生物活性的长期保持需要低温冷冻条件，同时等温扩增反应所需的寡聚核苷酸引物、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)和反应缓冲液等均需在冷冻条件下贮存，并且反复冻融会使这些成份失效，所以基于等温扩增技术的产品要求在低温冷冻条件进行运输和保存，这ー方面増加了运输成本，另ー方面也限制了这些产品在不具备低温保存条件的环境或地区的应用。对于大規模生产、商品化的基于等温扩增技术的产品，为了保证产品的一致性、稳定性和可靠性，也要求尽可能把各种反应试剂一次性添加和分装，并使产品在贮存和运输过程中具备尽可能长的保质期限。因此，专利技术一种能够方便有效保存等温扩增反应试剂混合物的方法具有重要的价值。申请号为200810159414. 3的专利技术专利“环介导等温扩增反应试剂混合物的保存方法”公开了ー种在环介导等温扩增反应试剂混合物中添加干燥保护剂然后进行真空干燥或快速风干实现环介导等温扩增反应试剂混合物常温长期保存的方法，但这种方法需要专门的真空冷冻干燥仪或快速风干机等复杂的设备，还需要消耗大量的能源，并不是ー种十分经济的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供ー种核酸等温扩增试剂的保存方法，能够使核酸等温扩增反应试剂的混合物在常温或室温长期保存，从而弥补现有技术的不足。 本专利技术的保存方法，是将ー种或几种核酸等温扩增反应液的组分包埋在凝胶内进行保存。上述的凝胶，其熔点低于用于核酸等温扩增的聚合酶的灭活温度。上述的凝胶，还包括有熔点高于用于核酸等温扩增的聚合酶的灭活温度的凝胶，这种高熔点的凝胶必须与熔点低于用于核酸等温扩增的聚合酶的灭活温度的凝胶同时添カロ，添加比例不高于熔点低于用于核酸等温扩增的聚合酶的灭活温度的凝胶质量的10%。上述的核酸等温扩增反应液的组分为用于核酸等温扩增的聚合酶。上述的核酸等温扩增反应液的组分还包括有引物、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)和/或三磷酸核苷酸(NTP)、核酸等温扩增的聚合酶的反应缓冲液中的任ー种或几种。上述的聚合酶为DNA聚合酶和/或RNA逆转录酶。上述的聚合酶为DNA聚合酶和/或RNA聚合酶。核酸等温扩增的聚合酶的反应缓冲液为核酸序列依赖性扩增的反应缓冲液、链替代扩增反应缓冲液或环介导等温扩增反应缓冲液。本专利技术的保存方法，ー种操作步骤如下首先将可形成凝胶的物质添加到核酸等 温扩增反应液的组分中，然后在低于核酸等温扩增聚合酶的灭活温度下将凝胶熔解，最后冷却凝固凝胶进行保存。本专利技术的保存方法，另ー种操作步骤如下首先将可形成凝胶的物质与水混合加热使之溶解配成浓缩的母液，然后将浓缩的母液加入到核酸等温扩增反应液的组分中，最后让温度下降使混合物由液态凝固为固态或半固态的凝胶进行保存。上述的可形成凝胶的物质在核酸等温扩增反应液的组分中的添加浓度质量体积百分比g/ml为O. 01% 30%。上述的可形成凝胶的物质为能形成凝胶的多糖类物质和/或明胶类物质。上述的可形成凝胶的物质为能形成凝胶的人工聚合物。上述能形成凝胶的多糖类物质和/或明胶类物质为淀粉、糊精、凝结多糖(又称凝结胶、凝胶多糖、热凝胶、可得然胶、卡德兰)、结冷胶、黄原胶、槐豆胶、亚麻籽胶、魔芋胶、壳聚糖、琼脂、琼脂糖、低熔点琼脂糖、超低熔点琼脂糖、红藻胶、海藻酸(又称藻酸、褐藻酸、海藻素)、海藻酸盐(如海藻酸钠，又被称为海藻胶、褐藻胶或藻胶)、卡拉胶、果胶、低甲氧基果胶、明胶、阿拉伯胶中的任ー种或几种。上述能形成凝胶的人工聚合物为甲基纤维素、羧甲基纤维素、丙烯酰胺、聚丙烯酰胺中的任ー种或几种。上述的凝结多糖在核酸等温扩增反应液的组分中的添加浓度质量体积百分比g/ml为O. 2% 3%，优选为O. 5% 2%。上述的超低熔点琼脂糖在核酸等温扩增反应液的组分中的添加浓度质量体积百分比g/ml为O. 3% 3. 5%，优选为O. 5% 3%。本专利技术方法处理后的等温扩增反应试剂混合物(核酸等温扩增反应液)，可常温贮存和运输，使用时无需特殊处理，直接使用即可。由于处理后的等温扩增反应试剂混合物呈固态状，可以很方便的进行航空运输，克服了此前反应试剂混合物呈液态较难利用航空方式进行长距离运输的难题。同时本专利技术的方法具有エ艺简单、成本低廉的特点，采用本专利技术方法处理后的等温扩增反应试剂混合物在便利的贮存条件下(常温或室温等温度条件)具有活性稳定持久的优点，这在大大降低等温扩增反应试剂的贮运成本的同时，还为等温扩增反应的实际操作带来极大的便利。该专利技术必将有力促进等温扩增技术的在科研、医疗、检验和检疫等领域的运用和基于等温扩增技术的诊断或检测试剂产品的大規模推广应用。具体实施例方式在目前的分子实验、检测操作中，若是直接将核酸等温扩增反应试剂(即核酸等温扩增反应液的组分)如引物、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)或三磷酸核苷酸(NTP)、聚合酶(DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶等)、聚合酶的反应缓冲液(不同类型的等温扩增反应需要不同的聚合酶和反应试剂)等的混合物保存在常温或者室温条件下，通常情况下f 2天后这些反应试剂混合物就失去了对目的核酸的扩增能力。研究发现，在常温或室温的条件下，等温扩增反应液(即等温扩增反应试剂混合物)中最容易失去反应活性的是聚合酶，而这些聚合酶丧失活性的主要原因是由于长时间保存、温度过高或温度变化导致酶活性中心維持高级结构的氢键、离子键、ニ硫键等分子作用カ受到破坏所致；在常温或室温条件下，等温扩增反应液(即等温扩增反应试剂混合物)中的寡聚核苷酸引物、dNTP也会很快降解，无法參与基因扩增。申请人在长期的研究中发现，在等温扩增反应试剂混合物中添加O. 019T30%(W/V，即重量体积比)可以形成凝胶的物质，加热至合适的温度使凝胶分子熔解(或溶解)，然后使反应试剂混合物温度下降，混合物可由液态变为固态(或半固态)的凝胶，聚合酶分子就 会被凝胶分子形成的三维网状结构所固定，酶分子的空间结构(三维结构或高级结构)得以长期维持，聚合酶的活性即可长期保持；凝胶也会将等温扩增反应试剂混合物中的引物、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)或三磷酸核苷酸(NTP)及聚合酶反应缓冲液中的各种成分固定，使其包埋在凝胶分子本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于凝胶的核酸等温扩增试剂的保存方法，其特征在于所述的保存方法是将ー种或几种核酸等温扩增反应液的组分包埋在凝胶内进行保存。2.如权利要求I所述的保存方法，其特征在于所述的凝胶，其熔点低于用于核酸等温扩增的聚合酶的灭活温度。3.如权利要求2所述的保存方法，其特征在于所述的凝胶，还包括有熔点高于核酸等温扩增的聚合酶的灭活温度的凝胶，且熔点高于核酸等温扩增的聚合酶的灭活温度的凝胶的添加质量不高于熔点低于核酸等温扩增的聚合酶的灭活温度的凝胶的10%。4.如权利要求I所述的保存方法，其特征在于所述的核酸等温扩增反应液的组分为用于核酸等温扩增的聚合酶。5.如权利要求4所述的保存方法，其特征在于所述的核酸等温扩增反应液的组分还包括有引物、三磷酸脱氧核苷酸dNTP和/或三磷酸核苷酸NTP、核酸等温扩增的聚合酶的反应缓冲液的任ー种或几种。6.如权利要求4或5所述的保存方法，其特征在于所述的核酸等温扩增的聚合酶为DNA聚合酶和/或RNA逆转录酶。7.如权利要求4或5所述的保存方法，其特征在于所述的核酸等温扩增的聚合酶为DNA聚合酶和/或RNA聚合酶。8.如权利要求5所述的保存方法，其特征在于所述的核酸等温扩增的聚合酶的反应缓冲液为依赖核酸序列的扩增的反应缓冲液、链替代扩增反应缓冲液或环介导等温扩增反应缓冲液。9.如权利要求I所述的保存方法，其特征在于操作步骤如下首先将可形成凝胶的物质添加到核酸等温扩增反应液的组分中，然后在低于核酸等温扩增聚合酶的灭活温度下将凝胶熔解，最后冷却凝固进...

【专利技术属性】
技术研发人员：张庆利，黄倢，史成银，梁艳，王勤涛，李美霞，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：