本发明专利技术公开了一种口蹄疫疫苗的免疫佐剂及其应用，属于生物疫苗领域。本发明专利技术的一种免疫佐剂为口蹄疫病毒3D蛋白片段。实验证明，表达的3D蛋白片段与抗原配伍后免疫动物，能够加强多表位抗原的免疫原性，产生高水平的保护性中和抗体。体外刺激实验显示，口蹄疫病毒3D蛋白片段单独或与多表位抗原配伍后能够发生淋巴细胞增殖反应，说明本发明专利技术的免疫佐剂不仅能够增强免疫反应，并且可用于区分感染和免疫动物，是一种很好的免疫刺激剂和疫苗分子标记。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种疫苗佐剂及其应用，特别涉及一种用于制备口蹄疫疫苗的免疫佐 剂及其应用。属于生物疫苗领域。
技术介绍
口蹄疫作为重大动物疫病严重威胁畜牧业的健康可持续发展，同时也影响动物食 品安全以及外贸出口。一旦发病损失重大，影响恶劣。灭活疫苗作为主要防控物质在控制 FMD疫情中发挥十分重要的作用，但由于生产此类疫苗需要建设防止病原体逃逸的高级别 生物安全生产车间，区分疫苗免疫和自然感染动物。更为严重的是病毒灭活不完全有引起 疫苗毒株流行的危险。为此，1991年后欧盟成员国禁止使用灭活疫苗进行疫情防控，美国也 禁止在其本国生产和使用灭活疫苗。2001年英国口蹄疫大流行造成的经济损失和影响引 起了全世界对口蹄疫防控策略的新讨论。研发安全高效的新型FMD疫苗成为热点问题，而 免疫效力低下及免疫持续期短仍然是制约新型疫苗发展的技术瓶颈。因此，如何提升新型 疫苗的免疫效力也是当前要解决的主要问题。目前包括水溶性佐剂(氢氧化铝)和油佐剂 (ISA206)在内的多种佐剂被用于改善疫苗的免疫效果，但是用于多表位小分子疫苗的效果 并不是十分理想。目前对于表位疫苗等小分子疫苗采用增加抗原表位，T细胞表位和引入蛋白载体 等多种措施提高疫苗的免疫原性，增强免疫应答能力、提升外周血循环抗体的水平和持续 时间，虽然在某种程度上明显提高了抗原的免疫原性，但还是达不到期望的效果。最近研究 结果显示，在FMDV进化中高度保守的FMD病毒非结构蛋白3D不仅能与所有血清型的FMDV 感染血清发生免疫反应，而且富集大量能被不同猪牛MHC分子等位基因识别的T细胞表位。 还发现重组3D蛋白能够诱导细胞免疫应答，提供部分保护性免疫应答反应，即免疫猪经强 毒攻击后免疫动物的症状明显减轻，发病时间延迟，但免疫动物血清中检测不到FMDV中和 性抗体。本专利技术研究结果显示，3D蛋白片段与重组表位蛋白联合免疫动物不仅能够改善 FMDV特异性抗体滴度，而且能够诱发细胞免疫应答反应。值得一提的是，经本专利技术表达的 3D蛋白N-端蛋白片段不仅发挥了免疫增强作用，而且不与FMDV感染血清发生免疫反应，是 一种十分理想的免疫佐剂，添加疫苗后不仅能够增强免疫反应，而且有利于区分感染和免 疫动物，是一种很好的免疫刺激剂和疫苗分子标记。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种可用于制备口蹄疫疫苗，增强免疫反应的免疫佐 剂；本专利技术的目的之二在于提供所述的免疫佐剂在制备口蹄疫疫苗中的应用；本专利技术的目的之三在于提供一种含有本专利技术所述的免疫佐剂的疫苗。本专利技术的目的是通过以下技术方案达到的本专利技术的一种口蹄疫疫苗免疫佐剂，其特征在于所述的免疫佐剂具有以下(a)或 (b)所示的氨基酸序列(a)SEQ ID NO 12 或 SEQ ID NO 14 或 SEQ ID NO 16 所示的氨基酸序列；或(b)将SEQ ID NO : 12或SEQ ID NO : 14或SEQ ID NO 16所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或插入而获得的仍具有口蹄疫病毒非结构蛋白3D功 能的蛋白衍生物。在本专利技术的一个具体实施例中，所述的免疫佐剂的氨基酸序列如SEQ ID N0:12或 SEQ ID N0:14 或 SEQ ID N0:16 所示。编码所述的免疫佐剂的核苷酸序列，其特征在于具有以下(a)、(b)或(c)所示的 核苷酸序列(a) SEQ ID NO 11 或 SEQ ID NO 13 或 SEQ ID NO 15 所示的核苷酸序列；或(b)编码SEQ ID NO : 12或SEQ ID NO : 14或SEQ ID NO 16所示的氨基酸序列的 核苷酸序列；或(c)编码具有口蹄疫病毒非结构蛋白3D功能的蛋白衍生物的核苷酸序列，该蛋白 衍生物通过将SEQ ID NO : 12或SEQ ID NO : 14或SEQ ID NO 16所示的氨基酸序列的一个 或多个氨基酸残基替换、缺失或插入而获得。在本专利技术的一个具体实施例中，所述的核苷酸序列如SEQ ID N0:11或SEQ ID NO 13 或 SEQ ID NO 15 所示。进一步的，本专利技术还提供了一种重组表达载体，其特征在于含有以上所述的核苷 酸序列。更进一步的，本专利技术还提供了一种宿主菌，其特征在于含有以上所述的重组表达 载体。再进一步的，本专利技术还提供了所述的免疫佐剂在制备口蹄疫疫苗中的应用。及所述的核苷酸序列在制备口蹄疫疫苗中的应用。最后，本专利技术提供了一种口蹄疫疫苗，其特征在于含本专利技术所述的免疫佐剂。本专利技术采用Asia 1型FMD病毒JS/China/05毒株的3D序列作为参考序列设计引 物扩增目的基因片段，并表达蛋白。实验证明，表达的3D蛋白片段与抗原配伍后免疫动物， 能够加强多表位抗原的免疫原性，产生高水平的保护性中和抗体。体外刺激实验显示，口蹄 疫病毒3D蛋白片段单独或与多表位抗原配伍后能够发生淋巴细胞增殖反应，说明本专利技术 的免疫佐剂能够增强免疫反应，并且可用于区分感染和免疫动物，是一种很好的免疫刺激 剂和疫苗分子标记。附图说明图1为3D蛋白不同片段单独或与抗原联合免疫小鼠血清抗体效价测定；图2为淋巴细胞增殖试验结果；图3为体外培养淋巴细胞经FMDV灭活抗原刺激后上清IL_4水平检测结果；图4为体外培养淋巴细胞经FMDV灭活抗原刺激后培养上清中IFN_ y水平；图5为表位疫苗免疫猪体效力试验结果。具体实施方案下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术 人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式 进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。实施例1 口蹄疫病毒3D蛋白不同片段的制备1、口蹄疫病毒3D蛋白基因的生物信息学分析口蹄疫病毒非结构蛋白3D是病毒RNA聚合酶，在口蹄疫病毒七个血清型中高度保 守，蛋白能与七个血清型病毒感染血清发生免疫反应。3D基因全长为1410个核苷酸，编码 一条长为470个氨基酸的蛋白，用DNAStar生物软件对获得的七个血清型46个代表毒株序 列分析及GenBank数据库比对，结果显示核苷酸同源性高于90 %，氨基酸同源性高于97 %， 高度保守。本研究采用Asia 1型FMD病毒JS/China/05毒株的3D序列作为参考序列设计 引物扩增目的基因片段，并表达蛋白。2、基因克隆及其蛋白表达，纯化用3D蛋白特异性引物扩增3D蛋白基因全长及其3个片段，口蹄疫病毒3D蛋白 基因全长核苷酸序列如SEQ ID No. 9所示，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID No. 10所 示，扩增3D蛋白基因全长引物，正链引物为5-GGATTGATAGTTGACACCAGAGA-3，负链引物为 5-TGCGTCACCGCACACGGCGTTC-3。编码N端片段(以3D1表示)的核苷酸序列如SEQ ID No. 11所示，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID No. 12所示，用于扩增N端片段的引物正链 弓 |物 3D-lU/BamHI 5' -CCCGGATCC GGATTGATAGTTGACACCAG-3'，负链引物 3D_1L/Hindl11 5本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邵军军，常惠芸，丛国正，林彤，高闪电，独军政，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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