本发明专利技术公开了一种高效CpG制剂及其制备方法和应用。所述CpG制剂中各组分的组成比例为：浓度为10～45μg/ml的CpG?ODN的PBS溶液80～120ml；白油160～180ml；Span-80?10～14ml；Tween-80?6～10ml；EMULSIGEN20～40ml。本发明专利技术制剂非常有利于强化抗原提呈细胞对抗原的摄取能力，促进Th1型免疫应答的形成，可以降低疫苗的使用量，提高疫苗的使用效果；本发明专利技术所述制剂的稳定性更高，更便于保存。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于兽用疫苗
，涉及一种兽用疫苗佐剂及其制备方法和应用，具体涉及一种高效 的疫苗佐剂CpG制剂及其制备方法和应用。
技术介绍
国内众多兽用疫苗生产企业的疫苗佐剂均是用铝佐剂或油佐剂，但该类佐剂有一定的副作用，油乳剂刺激局部产生肉芽肿或炎症反应铝佐剂可以引起注射部位局部炎症反应进而引起肉芽肿，个别的引起畜禽应激性反应导致个别个体死亡。且诱导的免疫应答是属于Th2型的，不足以起到完全的保护动物防感染的作用。虽然能增强体液免疫，抗体以IgG I类为主，不能明显地提高细胞介导免疫应答，不能增强细胞免疫，有局限性；还可能对动物体的神经系统造成伤害。主要适用于免疫能力强和可大量生产的抗原。因此制备安全高效的疫苗佐剂是非常必要的。含有特定非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpG基序)的寡核苷酸，即CpGODN(CpG oligodeoxynucleotides, CpG 0DN)是近年发现的被哺乳动物的免疫系统识别为“危险”信号的新型免疫增强剂，能激活人体和许多动物的先天性和适应性免疫系统。在多种动物模型上，已证实CpG ODN可作为疫苗(包括人用疫苗)一种安全的疫苗佐剂，而且与传统疫苗相比，可以较大程度减少疫苗抗原的使用量，因而过敏反应的可能性大幅度降低，部分已进入人体的二期临床研究(Murad和Clay, 2009 ；Vollmer和Krieg, 2009)。由于CpG ODN是一种安全的佐剂，多次动物实验已经证实高达100倍常规剂量的CpG ODN注射小鼠未发现明显的急性毒性作用，反复注射CpG ODN可为长期预防传染性病原体提供一种安全的方法(Klinman等，1999)。CpG ODN作为佐剂，可以诱导Thl型免疫应答，提升细胞免疫应答的水平，还具有降低疫苗的使用量，减少过敏反应等的优点。但是，目前尚没有将CpG直接应用到动物的疫苗免疫产品，主要原因在于其存在稳定性不强，时间长存放易降解，导致药效下降；保存条件较苛刻，要求在_20°C下等问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有的兽用疫苗佐剂不足，尤其是具有副作用、诱导Th2型免疫应答、只能适用于免疫能力强和可大量生产的抗原的技术难题，提供一种高效的疫苗佐剂CpG制剂，基于所述制剂，可成功实现降低疫苗的使用量、促进动物机体Thl型免疫的形成、提高疫苗的使用效果的目的。另一方面，本专利技术所述制剂较现有的CpG制剂更容易保存。本专利技术的另一个目的是提供所述CpG制剂的制备方法，所述的制备方法简单易行。本专利技术还有一个目的是提供所述CpG制剂的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案予以实现本专利技术提供一种高效CpG制剂，包括按照以下比例组成的各组分 CpG ODN 的 PBS 溶液10 45Kg/ml，80 120ml; 白油160 180ml; 司盘-80:10 14ml; 吐温-80:6 10 ml; EMULSIGEN水包油助剂20 40 ml。所述CpG ODN的序列为5’ -ggTGCATCGATGCAGggggg-3’，可采用现有基因工程或化学方法合成，其中g_表示该序列经硫代化处理(硫代化处理可以参考本领域的常规工艺进行)。合成后，用无菌PBS溶液配制成10 45 ii g/ml,保存于-15 _25°C温度下备用。所述PBS溶液组成为按照重量百分比计，0. 6 1.0%的NaCl、0. 01 0. 04%的KC1、0. 0124 0. 0164%的Na2HPO4'0. 014 0. 034%的KH2PO4溶于水中；然后采用湿热高压灭菌法在115 121°C下，灭菌15 25min。湿热高压灭菌法是本领域常用的灭菌方法，其操作可以参照现有技术进行。本专利技术同时提供所述CpG制剂的制备方法，将人工合成的CpG ODN与其他成份配合，再经乳化后，制备成CpG制剂。具体包括以下步骤(I)CpG ODN合成后,采用无菌PBS溶液配制成浓度为10 45 ii g/ml的CpG ODN溶液，-15 _25°C温度下保存备用；(2)取 160 180ml 白油和 10 14ml Span-80 和 6 IOml Tween-80,混合均勻得混合液，60 80°C水浴处理；(3)取20 40ml EMULSIGEN水包油佐剂与步骤(2)所得混合液混合均匀，保存备用；(4)往步骤⑴所得80 120ml CpG ODN溶液中加入步骤(3)溶液中，混合均匀，室温放置。其中，步骤(2)所述混合均勻是在200 600rpm/min下搅拌4 8min ;所述水浴处理是在60 80°C水浴20 30min。步骤(3)所述混合均勻是在200 600rpm/min下搅拌4 8min ;所述保存可放置于4 10°C温度下保存。步骤(4)所述混合均勻是在600 800rpm/min下搅拌4 8min乳化,混合均勻；步骤(4)所述室温放置的时间为20 30min ;收集混合液，即得CpG制剂。本专利技术提供所述高效CpG制剂的应用，应用于制备兽用疫苗佐剂。使用时将高效CpG制剂与疫苗抗原按体积比为I : I的比例配制(即0. 5ml高效CpG制剂与0. 5ml疫苗抗原混合)。采用本专利技术制剂，疫苗抗原的使用量可减少为使用现有常规佐剂时疫苗抗原使用量的一半。本专利技术具有以下有益效果(I)本专利技术确定了合理的配伍和比例，将CpG ODN与EM-白油乳化制备成新型的高效CpG制剂，所述制剂非常有利于强化抗原提呈细胞对抗原的摄取能力，促进Thl型免疫应答的形成，可以降低疫苗的使用量，提高疫苗的使用效果；(2)利用油制剂(白油和EMULSIGEN)、乳化剂(司盘-80和吐温-80)与CpG ODN有效乳化混合，可以有效提高CpG ODN的稳定性；并且可以促进抗原提呈细胞对抗原的摄取能力，进而减少抗原的使用量，提高抗原的免疫原性；(3)本专利技术的高效CpG制剂的克服了现有CpG制剂对保存条件的要求苛刻的问题，在4 10°C均能稳定保存；(4)本专利技术利用搅拌及低温或中温混匀的制备方法，简单易行，在制备成本低的情 况下，就能有效提高CpG ODN的稳定性，及抗原的免疫原性，降低疫苗的使用量。具体实施例方式下面结合具体实施例进一步详细说明本专利技术。所述CpG ODN的序列为5’ -ggTGCATCGATGCAGggggg-3’，可采用现有基因工程或化学方法合成，其中g-表示该序列经硫代化处理(硫代化处理可以参考本领域的常规工艺进行)。合成后，用无菌PBS溶液配制成不同浓度的CpG ODN的PBS溶液。实施例中，Span-80即司盘-80，Tween-80 即吐温-80，EMULSIGEN 即 EMULSIGEN 水包油助剂。实施例I CpG制剂的制备按照以下用量比准备原料 CpG ODN 的 PBS 溶液20Pg/ml， 80ml； 白油160ml; Span-80 10ml； Tween-80 7 ml； EMULSIGEN20ml。所述PBS组成为按照重量百分比计，0. 6%的NaCl、0. 01 %的KC1、0. 0124%的Na2HP04、0. 014% 的 KH2PO4 溶于水中；湿热高压灭菌115°C，15min。(I)CpG ODN由TAKARA公司本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种高效CpG制剂，其特征在于包括按照以下比例组成的各组分CpG ODN 的 PBS 溶液10 45Kg/ml，80 120ml;白油160 180ml;司盘-80:10 14ml;吐温-80:6 10 ml;EMULSIGEN水包油助剂20 40 ml; 所述PBS溶液组成为按照重量百分比计，O. 6 I. 0%的NaCl、0. 01 O. 04%的KCl、O.0124 O. 0164%的Na2HP04、0. 014 O. 034%的KH2PO4溶于水中，采用湿热高压灭菌法在115 121°C下，灭菌15 25min。2.权利要求I所述高效CpG制剂的应用，其特征在于应用于制备兽用疫苗佐剂。3.—种权利要求I所述高效CpG制剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤 (1)CpGODN合成后，采用无菌PBS溶液配制成10 45μ g/ml的CpG ODN溶液，于-15 _25°C温度下保存备用； (2)取160 18...
【专利技术属性】
技术研发人员：张玲华，李华周，姜增固，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：
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