用于生物学样品中大量荧光标记物的定位的系统和方法技术方案

公开了一种用于对生物样品内的荧光标记物例如荧光蛋白或者量子点进行成像和定位的方法和系统。利用重组遗传技术使“报告”基因插入很多物种中是被广泛认可的。特别是绿色荧光蛋白(GFPs)和范围从蓝色至黄色的其经遗传修饰的变体易于剪接到很多基因组中的目标基因(GoIs)位点处，其中GFPs被表达，对于由GoIs编码的目标蛋白质(PoIs)的功能没有明显影响。生物学家的一个目标是细胞内PoIs的更精确定位。本发明专利技术是利用带电粒子束诱导的对GFPs的破坏使PoI定位更加快速和精确的方法和系统。提出了系统的多个实施方案以实施本方法，以及相对不受高统计噪声水平影响的图像处理方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术总体涉及聚焦带电粒子束系统，并且具体地涉及用于对样品中的荧光标记物进行激发和定位的系统。
技术介绍
目前生物学研究正在日益集中于将多种细胞组分的细胞内位置确定至甚至更高的空间分辨率。对于电子显微镜(TEMs、STEMs、SEMs等)以及所有类型的光学显微镜，这涉及用以增强图像分辨率和对比度的很多不同的技术，包括最新的超分辨率技术。对于细胞结构、转运、代谢和运动的研究获得广泛认可的一种强效技术是应用 重组遗传技术将“报告”基因连接到“目标基因”(GoIs)上。因此，当特定GoI在正常的基因转录/翻译过程中表达时，报告基因也将表达，产生末端附着于由GoI编码的“目标蛋白质”(PoI)上的小蛋白质。一种公认的报告基因是编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因，这些报告基因可以以野生形式或者经遗传修饰的形式利用，并且所表达的GFPs具有发射波长从蓝色扩展至黄色的荧光。GFP相对小(29.6kDa，直径为3nm，长度为4nm)，其中其发色团被充分地保护在里面并且不需要任何辅因子以发射光。使GFP “发光”所需要的所有条件是利用波长比GFP的发射波长稍短的激光进行照射。GFPs显示对其所附着的PoI的适当功能基本上是“惰性的”，这在一些情况下通过利用短且灵活的多肽“接头”使GFP与PoI相连得以保证，所述接头使得GFP能够自由围绕蛋白质而摇摆，这可能是为了保持研究者所研究的细胞功能而必须不被干扰的一些胞内结构或者机制的一部分。显然，如果可以精确地确定GFP在细胞内的X-Y-Z位置(比如说精确度为IOnm)，则可以以类似的精确度得知PoI的位置。可以通过光学显微镜观察发荧光的GFP，因而可以在显微镜中看到PoI相对于样品中可观察到的结构的位置。已经提出并且在一些情况下阐述了现有技术中的几种技术，其用于由多种荧光标记物(FMs)例如GFPs以及量子点获得主要的位点信息。在一种技术中，使用绿色激光对样品中的荧光标记物(FMs)中的一小部分进行激发，接着使样品成像。利用高斯曲线(Gaussian curve)拟合,可以在基本小于成像系统的衍射极限的20nm的FWHM内确定FMs的位置。利用多次绿色激光闪光并且交替使用使荧光消失的红色荧光闪光，可以在通常可耗费数十分钟的过程中确定大量FMs的位置。在描述于Buijsse等人的美国专利号7，317，515 “对荧光标记物进行定位的方法”(转让于本申请的受让人，通过引用并入本文)的另一种技术中，带电粒子束对样品表面进行扫描，当束击中FM时破坏标记物并使荧光消失。当荧光消失时，FM的位置对应于带电粒子束的位点。由于可以将带电粒子束聚焦于比照射标记物的激光小得多的点，并且可以非常精确地确定扫描过程中任何时间处带电粒子束的位点，FM的位点以及因而PoI的位点可以以类似的精确度确定。在本文对本专利技术的所有描述中，术语GFP将用于表示可以被带电粒子束(包括电子或者离子)破坏的FMs较大家族，包括GFPs、有机染料以及无机标记物例如量子点(通常使其功能化，以使得能够选择性地附着于特定细胞内组分例如蛋白质、核酸等上)。用于对生物学样品中的FMs进行定位的很多现有技术方法仅对相对少量的FMs起作用，从中在任何一次使小的子集活化，因此成像时间可以是很多分钟并且仍然受到光学成像的一些限制。使用带电粒子束选择性地破坏样品中FMs的现有技术方法利用了仅能够处理相对少量FMs的图像处理方法，对于这些方法，统计学信噪比将其应用限制于不固有地以大密度出现的FMs。这特别是对于GFPs存在障碍，因为在基因转录成mRNA随后翻译成蛋白质(GoI+接头+GFP)的正常细胞过程中可以产生非常大量的任何类型的可表达标签(与功能化标签例如量子点相对)。因此，需要一种快速的方法以在时间框架内例如I分钟级对细胞内或者细胞组分中非常大量(彡10000)的FMsjB CFPs进行定位。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种改进的方法和设备，以定位样品中的目标蛋白质。一个优选的实施方案包括能够使含有荧光标记物(FMs)，例如绿色荧光蛋白(GFPs)或者量子点的样品成像的带电粒子设备和方法，其中利用标准的电子显微信号，例 如二次电子(secondary electrons, SEs)或者透射电子(未散射、弹性散射和/或非弹性散射)，同时利用激光激发FMs并收集由被激发的FMs发射的光。—个实施方案包括一种检测器光学器件(detector optics)配置,其对于二次电子和发射光均表现非常大的收集立体角，其中不存在两种类型检测器之间的干扰，所述干扰会倾向于使Ses和光各自的收集立体角减小。本专利技术的一些实施方案包括一种示例性图像处理方法，与利用现有技术中较简单的图像处理方案而可能发生的相比，其潜在地能够同时对较大(例如> 10000)数目的FMs进行定位(在持续大约I分钟的单次成像扫描过程中)。前面相当宽泛地概括了本专利技术的特性和技术优点，以便可以更好地理解以下对本专利技术的详细描述。本专利技术的附加特性和优点将在下文中描述。本领域技术人员应当理解的是，可以容易地利用所公开的构思和具体实施方案作为改动或者设计其他结构的基础，以实施本专利技术的相同目的。本领域技术人员还应当认识到，这种等同构造不背离所附权利要求中所说明的本专利技术的精神和范围。附图说明为了更全面地理解本专利技术和其优点，现参考以下描述以及所附附图，其中图I显示目标蛋白质(PoI)的示意图，其中绿色荧光蛋白(GFP)通过接头附着于其上。图2是X-Y扫描光栅的示意图，图解了含有GFPs的像素和不含GFPs的像素。图3是本专利技术的第一个实施方案的示意图，其包括位于样品上方的检测器光学器件。图4A是图3中的检测器光学器件的光和二次电子轨迹的侧视图。图4B是图3和4A中检测器光学器件的剖面等轴视图。图5是本专利技术的第二个实施方案的示意图，其包括位于样品下方的检测器光学器件。图6是本专利技术的第三个实施方案的示意图，其包括位于样品上方和下方的检测器光学器件。图7是在对含有100个GFPs的扫描场进行光栅扫描的过程中信号作为时间函数的图。图8是显示图7中图表初始阶段的特写图，其显示总共100个GFPs中前8个GPFs的破坏。图9是在对含有10000个GFPs的扫描场进行光栅扫描的过程中信号作为时间函数的图。 图10是显示图9中图表初始阶段的特写图，其显示总共10000个GFPs中前8个GPFs的破坏。图11是显示光栅扫描过程中具有统计噪声的原始信号和平滑信号作为时间函数的图，其显示总共100个GFPs中前3个GPFs的破坏。图12 是显不平滑函数和导函数(smoothing function and the derivativefunction)的图。图13是显示光栅扫描过程中具有统计噪声的原始信号、平滑信号和平滑导数作为时间函数的图，其显示总共100个GFPs中前3个GPFs的破坏。图14是显示光栅扫描过程中具有统计噪声的原始信号和平滑信号作为时间函数的图，其显示总共10000个GFPs中前3个GPFs的破坏。图15是显示光栅扫描过程中具有统计噪声的原始信号、平滑信号和平滑导数作为时间函数的图，其显示总共10000个GFPs中前3个GPFs的破坏。图16是显示图像处理方法的性能的柱状图，所述本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
2011.01.30 US 13/0170161.一种带电粒子系统，其包括 带电粒子光柱，其用于将带电粒子束引导至含有荧光标记物的样品上； 二次电子检测器，其用于收集带电粒子束撞击后由样品发射的二次电子； 光源，其用于激发样品中的荧光标记物； 光检测器，其用于检测由样品中的荧光标记物发射的荧光；和 电传导镜，配置所述镜以 将来自光源的光引导至包含带电粒子束与样品的碰撞点的样品区； 使由突光标记物发射的突光向光检测器反射；和 提供电场以使来自样品的二次电子偏转进入二次电子检测器。2.权利要求I的系统，其中所述镜是抛物面镜，其用于使光聚焦到样品区域上和用于收集来自样品区域的光，其中焦点接近于带电粒子束的碰撞点。3.权利要求I的系统，其进一步包括位于镜和光检测器之间的分束器，配置所述分束器以 将由镜反射的荧光传送进入光检测器；和 使来自光源的光向镜反射。4.权利要求3的系统，其进一步包括位于分束器和光检测器之间的滤色器，其中调整所述滤色器的透射比，以大大阻断来自光源的光的传送，而使由标记物发射的荧光穿过。5.权利要求I的系统，其中关于由样品发射的光和二次电子的立体收集角均大于π/2球面度。6.权利要求I的系统，其中所述荧光标记物包括由与目标基因连接的基因所表达的荧光标记物或者包括选择性地附着于特定细胞内组分的无机突光标记物。7.权利要求I的系统，其中所述光检测器包括多个检测器，配置所述多个检测器中的每个检测器以收集来自特定类型的荧光标记物的荧光。8.权利要求I的系统，其中所述光检测器和镜位于样品上方，其进一步包括 位于样品下方的透射式电子检测器； 用于由样品中的标记物发射的荧光的第二光检测器；和 位于样品和透射式电子检测器之间的第二镜，所述第二镜具有接近于带电粒子束与样品的碰撞点定位的焦点，配置所述第二镜以使由标记物发射的荧光向第二光检测器反射。9.一种带电粒子系统，其包括 带电粒子束源，其用于产生带电粒子； 带电粒子束光柱，其用于使来自带电粒子束源的带电粒子束聚焦于含有荧光标记物的样品上； 使样品保持于样品位点中的样品台，穿过样品位点的样品平面使空间分成包含带电粒子束源的样品平面上方的区域和样品平面下方的区域； 二次电子检测器，其用于收集由于带电粒子束与样品碰撞而由样品发射的二次电子，所述二次电子检测器位于样品平面的上方； 光源，其用于对样品中的荧光标记物进行照射，来自所述光源的光最初从样品上方照射样品； 光检测器，其用于检测由样品中的标记物发射的荧光；和位于样品平面上方的镜，配置所述镜以将来自光源的光引导至样品表面上，以使荧光标记物发突光，并且用于在光不完全穿过样品的情况下使由突光标记物发射的光偏转到光检测器上。10.权利要求9的带电粒子束系统，其中所述镜包括电传导性抛物面镜。11.权利要求10的带电粒子束系统，其中所述镜具有光的焦点，所述焦点的位置接近于带电粒子束与样品的碰撞点。12.权利要求11的带电粒子束系统，其中配置所述镜以 使来自光源的光聚焦于样品上；和 使由突光标记物发射的突光向光检测器反射。13.权利要求10的带电粒子束系统，其进一步包括具有孔的电极，带电粒子束穿过所述孔，并且配置所述电极以在电极和可配置以使来自样品的二次电子偏转进入二次电子检测器的电传导性抛物面镜之间提供电场。14.权利要求13的带电粒子束系统，其中所述电极经偏置为大约样品的电势。15.一种用于在带电粒子束系统中收集来自样品的带电粒子和...

【专利技术属性】
技术研发人员：N·W·帕克，M·W·乌特劳特，
申请(专利权)人：FEI公司，
类型：发明
国别省市：