【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及用于控制透射电子显微镜以便在低温电子显微镜(cryo-em)上执行单粒子分析(spa)的自动数据采集的目标定位方法。具体地，本专利技术提供了用于经由图像偏移处理来收集高放大率图像的改进的技术。
技术介绍
1、本专利技术涉及在对spa数据采集中的目标区域进行成像的同时提高束控制精度。
2、spa样品描述：
3、典型的spa样品包含许多冷冻在网格上的相同类型的生物大分子(大多由铜或金制成，直径约3毫米)。这种网格通常包含约500个网眼(“网格方块”，边长为约75微米的方块)。每个这样的方块包含薄碳箔，该薄碳箔具有数百个直径约为1微米(通常在0.2微米至2微米的范围内)的规则分布的孔。一种合适的冷冻方法是浸入冷冻(plunge-freezing)，该做法确保每个这样的洞都被包含多种生物大分子的无定形冰的薄层覆盖。其他冷冻方法注入喷射冷冻和基于印刷的冷冻也是可能的。
4、spa数据采集和束控制方案：
5、spa数据采集通常通过以下步骤执行：
6、(1)将显微镜设置为低放大率(lm)模式(通常为200至500倍)；
7、(2)在(1)的条件下采集导航图像(“网格方块图像”)；通常，这种导航图像的跨度为约10微米至100微米；
8、(3)使用导航图像来识别并选择箔孔的子集作为数据采集的目标区域；
9、(4)切换到高放大率(hm)模式(通常为20,000至100,000倍)；
10、(5)在箔孔位置处依次采集冰盖中生物分子
11、此处，“目标区域”是指要以hm在相机上捕获的区域(通常是所选择的冰箔或箔孔的一部分)；“目标位置”或“目标地点”是指目标区域的中心位置。
12、这些位置可以通过适当的载物台移动或通过使用电子显微镜的束偏转单元适当地偏转电子束来访问。导航图像用于确定使hm图像以箔孔的所选择的子集为中心所需的载物台移动和/或电子束偏转的幅度和方向。
13、通常，这种电子束偏转由两个同时和同步的动作组成：在样品上方的偏转和在样品下方的偏转。这两个偏转的组合效果是成像在相机上的样品的该部分远离光轴偏移(因此有效地模仿样品的机械运动)，并且因此这种电子束偏转通常被称为“图像偏移”。然而，由于在当前的显微镜中电子束偏转的范围被限制为距光轴几十微米(“离轴”)，因此需要样品台移动来执行更大的移动。
14、只要有可能，电子束偏转通常是优选的，因为以机械方式移动样品台要慢得多，并且会引入不期望的机械漂移，这可能导致记录图像中分辨率的损失。
15、用于收集大量spa图像的现有方法的一个示例是赛默飞世尔科学公司的epu(“epluribus unum”)软件，该软件包括图像偏移技术。这些图像偏移技术允许从离轴箔孔收集图像数据，而无需移动载物台以使这些箔孔更靠近物镜的光轴。因此，可以减少对网格方块上的预定义位置成像所需的载物台移动的次数。通过物镜的同时重新聚焦、图像的同时重新像散以及照射束的同时适当倾斜，可以使由这些图像偏移技术产生的光学像差最小化。
16、通过调整显微镜镜筒中的偏转器(实现束偏转的光学模块)的电流来实现上述图像偏移。设定电流与试样处观察到的图像偏移之间的关系在理论上是线性的，并且在图像偏移控制逻辑中建模。
17、然而，由该控制逻辑应用的图像偏移有时不能将束准确地偏移到预先选择的冰孔。换句话说，在从导航图像测量的冰孔位置与以施加到偏转线圈的电流表示的冰孔位置之间可能存在失配。这些失配通常被称为“目标定位误差”。当所需的图像偏移相对较大(例如，大于12微米)时，尤其可能发生目标定位误差。专利技术人假设并识别出这种误差可能源于对导航图像和在样品处观察到的偏移的以下线性和/或非线性贡献：
18、(1)导航图像或hm图像中的失真；这些失真可能是由于电子显微镜的透镜固有的光学像差，诸如三阶图像失真，但是这些失真也可能是由于机械缺陷导致的光学像差，诸如电子显微镜的透镜的轻微不圆度或轻微偏移。
19、(2)样品高度与显微镜在图像检测器上成像的光学平面的局部偏差；这种偏差，特别是与照射束的倾斜相结合，会导致预期在相机上成像的样品的位置与实际在相机上成像的样品的位置之间的差异。
20、当这种目标定位误差与hm图像的跨度相比变得相当大时(例如，当hm图像的跨度为200nm并且目标定位误差超过50nm时)，则hm图像不再正确地捕获目标冰箔，并且spa数据采集变得低效。因此，用于收集大量spa图像的现有方法可采用图像偏移的校准的过程以减少spa数据采集中的目标定位误差。现有技术的图像偏移校准过程通常包括以下步骤：
21、(1)以中等放大率(mm，约5000倍)，拍摄预定义数量的辅助图像或“校准图像”或“箔孔图像”，这些图像以将以高放大率记录的冰箔或箔孔的目标位置的预定义子集{ui}为中心(此处，ui是表示所应用的图像偏移的二维矢量)，
22、(2)使用图像处理算法来精确地定位在(1)中采集的校准图像中的孔的中心，并且从其导出在相机上成像的试样上的实际位置的集合{u'i}(此处u′i是表示实际观察到的图像偏移的二维矢量)；目标定位误差δi由目标定位位置与实际成像位置之间的差值给出，δi＝u′i-ui；
23、(3)将线性模型u′ifit＝m·ui+s拟合到数据集{ui,u′i}，其中2×2矩阵m考虑了可能的缩放、旋转和剪切，矢量s考虑了可能的偏移—或者等效地，也可以使用模型δifit＝(m-1)·ui+s将线性模型拟合到数据集{ui,δi}中，其中1表示2×2单位矩阵；
24、(4)应用在(3)中拟合的模型以采集校准的位置处的hm图像ucal＝m-1(u-s)。
25、然而，在上述现有技术的校准过程中存在几个缺陷，诸如：
26、(1)目标定位误差具有未建模的非线性分量。
27、(2)在校准期间不能调整目标区域的预定义子集和采集顺序。由于箔孔图案的周期性，这会在定位箔孔中心时导致测量误差。
28、(3)没有使用样品高度可变性的知识。
29、(4)由于箔孔中心查找算法仅辨别某些预定义几何形状，因此它不能对包含不规则孔的样品起作用。
30、(5)如果没有适当地选择校准目标，则可能在拟合中引入方向偏差。
31、为此，spa采集协议的当前具体实施将图像偏移限制为通常小于约12微米，以便防止否则将损害spa采集过程的有效性的过度目标定位误差。因此，spa采集的当前具体实施将图像偏移与样品的机械移动相组合，其中后者用于进行通常大于12微米的偏移。
32、本专利技术的目的是减少目标定位误差，以便实现更长范围的图像偏移，并且由此减少所需本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于透射电子显微镜的自动数据采集方法，所述方法包括：
2.根据任一前述权利要求所述的方法，还包括：
3.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述下一目标位置是第二多个目标位置中的一个目标位置，并且对于所述第二多个目标位置中的每个目标位置，所述方法包括：
4.根据权利要求3所述的方法，还包括：
5.根据权利要求3所述的方法，还包括：
6.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述第一多个目标位置被选择为使得所述目标位置和所识别的表观偏移足以训练所述非线性模型，使得所述非线性模型在所述第二多个目标位置处是准确的。
7.根据任一前述权利要求所述的方法，还包括：
8.根据任一前述权利要求所述的方法，其中，对于所述第一多个目标位置、所述下一目标位置、所述第二多个目标位置和/或所述第三多个目标位置中的每一者：
9.根据任一前述权利要求所述的方法，还包括：
10.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述非线性模型被配置为估计通过将所述电子束引导到所述目标位置而获得的图像中的所述样品
11.根据任一前述权利要求所述的方法，其中引导所述电子束包括调整所述电子束的倾斜和/或偏移，优选地通过以下方式：
12.根据任一前述权利要求所述的方法，其中使用图像处理技术来识别所述校准图像中的所述目标位置的所述预期位置与所述校准图像中的所述目标位置的所述观察位置之间的表观偏移包括：
13.根据任一前述权利要求所述的方法，还包括：
14.一种被配置为执行权利要求1至13中任一项所述的方法的透射电子显微镜设备。
15.一种计算机软件，所述计算机软件包括指令，所述指令当在计算机的处理器上执行时，使得所述计算机执行权利要求1至13中任一项所述的方法。
...【技术特征摘要】
1.一种用于透射电子显微镜的自动数据采集方法，所述方法包括：
2.根据任一前述权利要求所述的方法，还包括：
3.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述下一目标位置是第二多个目标位置中的一个目标位置，并且对于所述第二多个目标位置中的每个目标位置，所述方法包括：
4.根据权利要求3所述的方法，还包括：
5.根据权利要求3所述的方法，还包括：
6.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述第一多个目标位置被选择为使得所述目标位置和所识别的表观偏移足以训练所述非线性模型，使得所述非线性模型在所述第二多个目标位置处是准确的。
7.根据任一前述权利要求所述的方法，还包括：
8.根据任一前述权利要求所述的方法，其中，对于所述第一多个目标位置、所述下一目标位置、所述第二多个目标位置和/或所述第三多个目标位置中的每一者：
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【专利技术属性】
技术研发人员：邓雨辰，H·科尔，B·范克尼彭伯格，P·铁美杰尔，L·于，
申请(专利权)人：FEI公司，
类型：发明
国别省市：
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