本发明专利技术涉及分子疫苗学领域，具体的说是一种荧光假单胞菌重组蛋白疫苗及其制备方法。疫苗抗原为序列表SEQ?ID?No.1中的氨基酸序列所示。具体为以荧光假单胞菌TSS1为模板，采用F1/R1为引物进行PCR扩增，PCR产物与载体pEASY-E2连接，连接液转化入大肠杆菌DH5α，筛选质粒pE478，质粒pE478转化大肠杆菌BL21(DE?3)表达的含序列表SEQ?ID?No.1中的氨基酸的重组蛋白。本发明专利技术的疫苗对荧光假单胞菌的免疫保护效率达81％。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子疫苗学领域，具体的说是一种荧光假单胞菌重组蛋白疫苗及其制备方法。
技术介绍
突光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)是一种革兰氏阴性杆菌,能够感染多种养殖经济鱼类，包括鲤鱼、罗非鱼、牙鲆等。荧光假单胞菌感染鱼类诱发一种被成为“红皮病”的疾病，其症状为体表出血和溃烂，从而给产业造成严重的经济损失。目前，荧光假单胞菌病害防治尚无有效的疫苗，主要依赖抗生素类药物的使用。因此，针对荧光假单胞菌的疫苗研发在我国亟需开展。重组亚单位疫苗是一种常见的疫苗形式，其主要原理是利用病原自身的一个抗原，经异源表达后作为疫苗应用，从而起到对病原的免疫保护作用。我们在前期研究中发现荧光假单胞菌的一个外膜蛋白P478具有良好的免疫原性，在此基础上将其构建成了一个重组亚单位疫苗。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种荧光假单胞菌重组蛋白疫苗及其制备。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为一种荧光假单胞菌重组蛋白疫苗，疫苗抗原为序列表SEQ ID No. I中的氨基酸序列所示。所述重组蛋白疫苗为含有列表SEQ ID No. I的真核重组表达质粒pE478。所述重组蛋白疫苗为含有列表SEQ ID No. I的真核重组表达质粒pE478转化大肠杆菌表达的重组蛋白。荧光假单胞菌重组蛋白疫苗的制备方法以荧光假单胞菌TSSl为模板，采用Fl/Rl为引物进行PCR扩增，PCR产物与载体pEASY-E2连接，连接液转化入大肠杆菌DH5 α，筛选质粒ΡΕ478，质粒ρΕ478转化大肠杆菌BL21 (DE3)表达的含序列表SEQ ID No. I中的氨基酸的重组蛋白；所述引物为Fl :5’ -CATATGAACGACAACACTCTTTATG-3，；R1 5’ -CTCGAGGAAGTTGGCCTCCAGC-3’。荧光假单胞菌重组蛋白疫苗的应用，所述重组蛋白疫苗在制备具有预防和治疗荧光假单胞菌疫苗制剂中的应用本专利技术具有如下优点I.高保护性。本专利技术的疫苗对荧光假单胞菌的免疫保护效率达81%。2.无需商业化佐剂。附图说明图I为本专利技术实施例提供的纯化的疫苗蛋白(泳道2)。泳道1，分子量标准。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步说明。实施例旨在对本专利技术进行举例描述，而非以任何形式对本专利技术进行限制。在本专利技术实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法I.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。2.质粒、DNA连接液转化进入大肠杆菌皆用Hanahan方法(Sambrook andRussell Molecular Cloning :A Laboratory Mannual. Cold Spring Harbor LaboratoryPress 2001)；3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“北京，纽英伦生物技术有限公司”。实施例I荧光假单胞菌疫苗抗原为序列表SEQ ID No. I中的氨基酸序列所示(参见序列表I)。序列表IMSVRDLHVNDNTLYALLLASGLGGFAPLVLADDAQDVGSVNIAGKQTLGSGHMILEESAKARSTVTKQAMDEMSATANAIDKLKYTPGINVSSDDASGTSGTNFTMRGMSSDQVGVSVDGVPINDSGNYSVYSNQLGDPENLAKVFATQGSSEADGPHIGSSGGNIGMITIRPTKDAGVFAKQIVGANALRKTFVRANTCDLGGLKTWVSASHLE⑶KWRGKGTLRSDKIEWSSLi7E ⑶ NGNSTLATIKYNKQENYNYNSLSKAQFDTEGRRKDYAQSPVYKAGLLSASYKLNRNPFESVNATLTQRWQLQDNLSLTLTPYYYffANGGSFSGQTASNLGPKSDKAGNYDLSNLQSANYYRPSWTETWRPGFTAKMKWDINEEHSLDYGYWYERARQRQTQPFIGINNEGAPDDVWGDYNSGGQVVDKNGATVQGRHYYTVTPAQKLWVQDNWQATPDLSFVGGVAYQYVERDGNNLGSLYDTPEKRNTRYHQFLPNFSAKYQLDDSNQAFYNVTRNMRTPPNYVLYNKGDSVSLKSELSWNQELGWRYTEDDMALSATLFYISFKDRQVSTTDAS⑶YMVLNVGTVDNKGLELEWSGLLPHNFNYYASYTYTQSEQKDDLLSKNVLLPTSGKQLANVPENMFNLVFGYDDSRFYGNIAGKYVGSFYGDLTNKEKIEGRTVFDLNAGIYLPVDKKVIKSAALRFSMLNVFDKEYLSSARTVAFNSAPVNGLGASTAYYNVGEERTAMVSLEANF(a)序列特征 长度753 类型氨基酸序列籲链型单链 拓扑结构线性(b)分子类型蛋白质(C)假设否(d)反义否(e)最初来源荧光假单胞菌TSSl(f)特异性名称P478结构特征该蛋白具有一个信号肽结构(氨基酸1-24)和一个TonB依赖型蛋白的P Iug功能域(氨基酸48-156)。实施例2荧光假单胞菌疫苗表达载体的构建方法质粒pE478的构建以荧光假单胞菌 TSSl为模板，采用F1/R1为引物进行PCR扩增，PCR条件为94°C 60s预变性模板DNA，然后940C 40s, 50°C 60s, 72°C 60s, 5 个循环；然后 94°C 40s, 58°C 60s, 72°C 60s, 25 个循环后再在72°C延伸反应lOmin。PCR产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化后与载体pEASY_E2 (购自于“北京全式金生物技术有限公司”)于室温连接2-4小时，连接混合液转化大肠杆菌DH5 α后在含有100ug/ml安卡青霉素(Ap)的LB固体培养基上培养18小时，挑取一个转化子，提取质粒，即为质粒PE478。所述LB组成成分按重量百分比计1. O %蛋白胨，O. 5 %酵母粉，I. O %氯化钠，97. 5 %蒸馏水；所述菌株TSSl保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC No. 2329，分类命名为荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens),保藏日期2008年I月9日。所述引物为Fl :5’ -CATATGAACGACAACACTCTTTATG-3’ 和 Rl 5’ -CTCGAGGAAGTTGGCCTCCAGC-3’。P478疫苗蛋白的诱导表达和纯化将上述的质粒PE478用常规方法转化大肠杆菌BL21 (DE 3)(购自于“天根生化科技有限公司”，北京)，在含有Ap (100ug/ml)的LB固体培养基上培养18-24小时，挑取一个转化子，将其命名为BL21/pE478。将BL21/pE478于含有Ap(100ug/ml)的LB液体培养基中过夜培养；取Iml过夜后的培养液，加入IOOml新鲜的含有Ap (100ug/ml)的LB液体培养基中，于37°C下转速200rpm摇动培养至0D_为0. 6，加入终浓度为ImM的IPTG，37°C继续以转速160rpm摇动培养4_5h，而后以5000g本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：胡永华，孙黎，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：
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