本发明专利技术涉及抗菌蛋白ＰｏｐＷ与生防菌的混合生防制剂ＰｏｐＷ－ＰＦ１，属于植物保护技术领域。由荧光假单胞菌制成的生防菌剂成品中活菌总浓度为１×１０９ＣＦＵ／ｍｌ；抗菌蛋白ＰｏｐＷ的浓度为３０ｍｇ／ｍｌ，稀释３００－３００００倍使用；混合生防制剂ＰｏｐＷ－ＰＦ１中，ＰｏｐＷ蛋白和生防菌剂的混合体积比为（３００００－３０）∶１，使用时稀释５０－１００倍。混合生防制剂ＰｏｐＷ－ＰＦ１对辣椒、番茄等蔬菜作物和水稻、大豆等粮食作物上的病毒病的防病效果达５０％以上，对地上部其它病害也有较好的防治效果如叶霉病和水稻稻曲病等，其增产效果达１０％。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及提高作物抗病性的PopW抗菌蛋白与荧光假单胞菌的混合生防制剂Popff-PFl, 一种来自青枯劳尔氏菌Ralstonia solanacearum ZJ3721抗菌蛋白PopW和防治植物病害的生防菌荧光假单胞菌，属于生物防治领域，专用于多种蔬菜和粮食作物的无公害防治。
技术介绍
现在世界上已知的植物病毒(包括类病毒)有I目10科47属850余种。植物病毒病是非常严重的植物病害，防治非常困难，素有“植物癌症”之称。植物病毒病害的爆发十分广泛，灾害非常严重。几乎所有蔬菜、粮食作物、果木等都感染病毒病，使农业生产受到巨大损失，降低产品品质，并严重促使植物其它生理性病害的发生。全世界每年因植物病毒病 造成作物危害的损失约为200亿美元。目前在防治病毒病方面的主要措施为选育抗病品种和施用抗病毒制剂，抗病毒制剂的作用以抑制病毒的活性和诱导作物产生抗病性为主。抗病品种的选育被誉为防治病毒病的基础措施，但在防治某些植物的病毒病方面差距较大，例如烟草，因为抗病品种同时伴随着劣质基因，获得抗病、优质的双重特性难度较大。除病毒病外，在田间实际生产中作物还要遭受真菌、细菌、线虫等病原物的危害。目前对这些病害，人们主要采用化学杀虫剂、选种抗病作物品种、实施轮作、建立无病种苗基地和对进出口农作物进行严格的检疫来控制病害的发生。化学药剂虽防效显著，但其选择性差，破坏农作物的生态环境；不易降解，高残留，对人畜极不安全；破坏土壤结构，造成土壤沙化；抗药性问题日益突出。随着人们对无污染、无公害绿色食品呼声日益提高，生物防治已成为继农业化学防治之后的又一重要防治方法。许多生物制剂及抗菌蛋白已相继问世，并广泛应用于实际生产当中，现已取得显著效果。Harpins是受hrp基因调节并通过III型泌出通道分泌的一类蛋白质。经过大量的研究发现，harp ins具有相似的生化特性富含甘氨酸(Gly)、不含半胱氨酸(Cys)、热稳定、对蛋白酶敏感。harpins还有相似的功能，都是不亲和病原细菌在烟草等植物上诱导HR或HCD的效应分子。体外重组表达后的harpins使用在植物上，可诱导产生多种有益表型，如使植物增强对病原物和害虫的抗性，并促进大多数植物生长，增强植物抗旱性，促进植物生长并且减少作物产后损失等。Harpins可以引起植物细胞离子渗漏、氧爆发、某些蛋白质激酶的激活等多种信号传导相关联的反应。在某些信号传导事件与表型效应之间，可以发现一定程度的因果关系。鉴于这种特性，国内外已把harpins作为一种新型的生化诱导剂进行了广泛而深入的研制和开发，并取得了较好的效果。在本实验室前期研究中，我们从R. solanacearum ZJ3721中克隆了 popW基因,通过体外表达获得PopW蛋白。PopW蛋白分子量为39. 79KDa,酸性，富含甘氨酸和丝氨酸，缺少半胱氨酸，耐热，能在非寄主植物烟草上引起过敏性反应，属一种新的Harpin蛋白。该蛋白对烟草、辣椒和番茄等病毒病(TMV/CMV)的温室和大田防效均为50%以上，增产效果10%以上。同时该蛋白还可以增强番茄对叶霉病，水稻对稻曲病的抗病性，其防效分别可达同时对辣椒疫病也有一定的防治效果。在美国有同类的蛋白类产品Messenger(美国Eden公司)该产品在中国已有登记，但是因为成本和价格过高，在美国和中国市场销路均未拓开。本课题组研制的PopW与之相比具有完全不同的结构和序列，但具有类似功能，对于烟草花叶病毒的田间防治效果显著高于Messenger ;而PopW的生产成本远低于此。可见PopW抗菌蛋白的应用前景更为广泛。由于田间环境条件复杂多变，而且种植作物、土质、气候和管理等方面的差异，导致在实际生产过程中并非只发生单一病害，大部分情况是多种病害同时发生。而单一的生防菌只能防治少数几种病害，其防病谱虽较化学药剂较广，但还是难以满足广大用户的要求。已有研究表明抗菌蛋白与其他生防因子混合使用后可产生具有协同增效作用，Lorito表明Enterobacter cloacae是一种生防细菌,但产生内切几丁质酶能力很低,其生防活性是与细菌个体与病原菌细胞壁的结合相关。试验表明，在木霉内切几丁质酶的参与下，该细菌附着在灰葡萄孢霉的孢子和菌丝上并大量繁殖，因而增强了生防效果，同时两者混合使用可使抗菌谱扩大。本实验室已证明抗菌蛋白与生防菌混合使用后对病害的防治效果要显著高于两者单独使用，防效达50%以上，同时防治病害的种类也明显增加。三、
技术实现思路
技术问题本专利技术的目的是针对现有的对防治大田常见病害有较高防效的生防制剂抗菌谱较窄、成本高，并且有时只针对单一性的病害的缺陷，提供开发一种抗菌蛋白和生防菌混合使用的生防制剂，可以针对田间的多种病害同时进行防治，防效达50%以上，显著高于抗菌蛋白和生防菌单独使用的情况，并且有增产功能。技术方案生防菌4AT8为突光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens),菌种保藏号为CGMCCN0. 3834。保藏日期2010年05月13日，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。用所述生防菌4AT8制备生防菌剂的方法，包括I)将所述荧光假单胞菌4AT8接种到KB培养液中分别培养28°C 180rpm, 16 20小时后在超净工作台中分别取样测600nm处的OD值，测定过程中以未接菌的培养液来调零；所用的KB即金氏B的配方为:蛋白胨20g/L, K2HPO4 I. 5g/L，MgSO4. 7H20 I. 5g/L，加入水溶解，最后定容至IOOOmL,调pH 7. 0-7. 2，分装后高压灭菌；2)当培养至OD值在O. 5 O. 8之间时，将种子菌液以I : 100体积比加入KB培养液中，28°C 180rpm振荡培养20 24小时，成品中活菌总浓度为lX109CFU/ml。所述生防菌剂可以在防治蔬菜和大田作物病害中的应用。本专利技术还提供了一种PopW抗菌蛋白与所述生防菌的混合生防制剂PopW-PFl，该制剂含有来自青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum) ZJ3721的popW基因在大肠杆菌BL2KDE3)中的表达产物抗菌蛋白PopW和所述荧光假单胞菌4AT8制备的生防菌剂。其中PopW抗菌蛋白制备的方法为将含有青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)ZJ3721的popW基因的重组质粒pET-popW转化大肠杆菌BL21(DE3)中，阳性克隆接种到含有50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37°C，180rpm振荡培养过液，第二天按I %的比例接入含有50mg/L卡那霉素的新鲜LB液体培养基中，37°C振荡培养3小时，然后加入终浓度为I. OmM的异丙基-β -D-硫代半乳糖苷IPTG，37°C继续振荡培养3h，将摇好的菌液6，OOOg, 4°C，离心lOmin，收集菌体，然后用1/100体积的20mM tris-HCL,pH 8. O缓冲液，加入终浓度为ImM苯甲基磺酰氟PMSF重悬菌体，超声波破碎菌液至清透，10, 000g，4°C，离心20min收集上清液，收集到的上清即为可溶性蛋白PopW，其浓度为30mg/ml，大小为本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郭坚华，刘红霞，曹静，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：84
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。