本发明专利技术涉及一种简便的农杆菌介导甘蔗转基因方法，包括抑菌剂的配制、培养容器消毒、农杆菌转化、培养基配制、共培养、选择培养、筛选培养、壮苗培养和生根培养；本发明专利技术的抑菌剂配制方法简单；培养基配制，只要按不同的培养基配方常规方法配制后，再加上抑菌剂即可；培养容器和培养基都无需高温高压灭菌，这在以农杆菌介导的甘蔗转基因的培养基配制上，大大地减少了工作量和能源消耗，简化了组培环节，降低了组培成本，与常规的农杆菌介导甘蔗转基因方法对比，可以降低成本10%以上。本发明专利技术简便的农杆菌介导甘蔗转基因方法，操作简单，实用性强，推广性好。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种植物转基因方法，具体涉及，属生物
技术介绍
基因工程是指按照人们的愿望，通过严密的实验设计，利用体外DNA重组和转基因等技术，在较短的时间内创造出更符合人们需求的目标生物类型。随着现代分子生物学理论的发展和研究技术的进步，利用基因工程技术开展生物品种的定向改良和目标性状育种成为可能，其中利用转基因技术改良作物品种具有独特的优势。其中，狭义的转基因技术主要有两种，一是基因枪介导方法，二是农杆菌介导方法。基因枪介导的转基因技术在甘蔗上已经有较多成功的应用实例，但是，该技术具有运行费用高、目的基因插入位点不确定、获得的转基因株系几乎都是多拷贝等缺点。与基因枪介导的转基因技术相比，农杆菌介导的转基因技术具有以下几个优点1、无需昂贵设备，所采用试剂皆为常规试剂，运行费用低；2、目的基因插入位点明确；3、获得单拷贝转基因后代频率高，性状遗传稳定性高，同时，由于该途径获得的转基因后代为单拷贝或低拷贝，转基因安全性较高。转基因甘蔗的研制及其商品化应用具有独特的优势。首先，甘蔗是无性繁殖作物， 在我国蔗区栽培条件下一般不开花，即使在某些特殊气候地区开花，其花粉也是败育的，转基因植株的外源基因不易漂移，生态安全性较好；其次，甘蔗是蔗糖或燃料乙醇的工业原料，加工蔗糖需要经过107 °C的高温炼煮，外源基因表达的蛋白必然会被分解，而燃料乙醇又非食用品，转基因食品安全系数较高；再次，甘蔗是天然的工业化工原料，转基因原料同样是集中加工的，不容易扩散；最后，转基因甘蔗植株可在短时间内经组培扩繁获得大量种苗，商品化进程快。综上所述，甘蔗不仅是转基因安全等级最高(IV级)的作物，同时也是转基因改良最容易成功的作物之一。迄今，水稻等为数不多的几种单子叶植物的农杆菌介导转基因方法已经比较成熟，但是，相对双子叶植物而言，单子叶植物农杆菌介导的转化率总体比较低，其中农杆菌介导遗传转化甘蔗的效率不高，已经成为农杆菌介导的甘蔗转基因育种的“瓶颈”问题，因为只有获得一定数量规模的转基因甘蔗群体，才有可能筛选到优良的单株。因此，农杆菌介导的甘蔗转基因实验中，大量的工作都集中在培养基的配制和接种，尤其是培养基的配制。在常规的农杆菌介导甘蔗转基因过程中，需要添加一些能抑制农杆菌生长的抗生素，这些抗生素不耐高温高压，只能通过过滤灭菌后才能加入培养基中。常规情况下是，培养容器和培养基经过高温高压灭菌后，冷却到40 0C-50 °C，再加入经过滤灭菌后的抗生素，然后分装到培养容器，冷却凝固后备用。以上工作程序繁锁、工作量大。如果能找到一种无需高温高压、又能抑制农杆菌生长、同时还不影响甘蔗正常生长的培养基， 就可以解决以上问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供。本专利技术的目的是通过以下方法实现的。本专利技术的，包括抑菌剂的配制、培养容器消毒、农杆菌转化、培养基配制、共培养、选择培养、筛选培养、壮苗培养和生根培养，其特征在于1.抑菌剂的配制使用益培隆杀菌剂配制抑菌剂1号和抑菌剂2号；抑菌剂1号的配制方法在益培隆杀菌剂A瓶药剂中加入20 ml蒸馏水稀释后与B瓶药剂混合，并用蒸馏水定容到100 ml，即为抑菌剂1号；抑菌剂2号的配制方法在益培隆杀菌剂A瓶药剂中加入 20 ml蒸馏水稀释后与B瓶药剂混合，加入6 g Timentin，并用蒸馏水定容到100 ml，即为抑菌剂2号；所述益培隆杀菌剂由A瓶药剂和B瓶药剂组成；Timentin为一种抗生素，固体， 由替卡西林钠与克拉维酸钾，按照重量比为15:1的比例组成，其中替卡西林钠纯度不低于 99. 1%，卡拉维酸钾纯度不低于99. 2%，由市场购得；Timentin具有广谱杀菌作用；2.培养容器消毒将培养瓶及瓶盖在抑菌剂1号与水的体积比为0.3 % 0. 5 %(V / V)的水溶液中浸泡不少于10 h，保存备用；3.农杆菌转化选择携带bar基因的植物表达载体，导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105中、制备转化菌液、侵染甘蔗心叶；4.培养基配制共培养培养基为1/2MS+3.0 mg/L 2，4-D+100 μ mol/L乙酰丁香酮 +3 5 ml/L抑菌剂2号+20. 0 g/L蔗糖+3. 5 g/L琼脂粉，pH5. 8 ；选择培养基为MS+3. 0 mg/L 2，4-D+3 5 ml/L抑菌剂2号+30. 0 g/L蔗糖+3. 5 g/L琼脂粉，pH5. 8 ；筛选培养基为 MS+2 mg/L 6-BA+0. 2 mg/L NAA+2 6 mg/L PPT+3 5 ml/L 抑菌剂 2 号 +30. 0 g/L 蔗糖 +3. 5 g/L 琼脂粉，pH5. 8 ；壮苗培养基为 MS+0. 5 1 mg/L 6-BA+0. 5 1 mg/L KT+3 5 ml/L抑菌剂2号+30. 0 g/L蔗糖+3. 5 g/L琼脂粉，ρΗ5· 8 ；生根培养基为1/2MS+3 mg/L NAA+3 5 ml/L抑菌剂2号+40 g/L蔗糖+3. 5 g/L琼脂粉，pH5. 8 ；所述MS培养基为1962 年，Murashige和Skoog公开的MS培养基；所述2，4-D，指2，4- 二氯苯氧乙酸；所述6-BA，指 6-苄氨基嘌吟；所述NAA，指^ -萘乙酸；所述KT，指6-糠氨基嘌吟；配制培养基时，先不加抑菌剂2号，按各培养基配方配齐其他原料后，用蒸馏水定容、加热至琼脂粉完全溶解，然后按各培养基配方添加抑菌剂2号，用1 mol/L的NaOH或1 mol/L的HCl调pH值至5. 8， 分装到培养容器中，封口，冷却凝固后备用；5.共培养将侵染后的材料从转化菌液中取出后，用灭菌滤纸吸干表面的转化菌液， 然后转至共培养培养基上，在22 °C黑暗条件下共培养3 d；6.选择培养将共培养后的材料移至选择培养基中，在观！黑暗条件下培养二代， 每14 d转接一次为一代；7.筛选培养将选择培养后的材料移至筛选培养基上，15d部分愈伤组织分化出小芽；培养室温度为观°C，光照12 h，光照强度为1200 Ix ；8.壮苗培养将筛选培养后获得的小芽转到壮苗培养基上，15d后形成小苗；培养室温度为28 °C，光照12 h，光照强度为1200 Ix ；9.生根培养将壮苗培养后获得的小苗分成单株接种到生根培养基上，15 30d即可形成完整植株；培养室温度为观°C，光照12 h，光照强度为1500 Ix0本专利技术的应用效果1.本专利技术培养基对农杆菌侵染后的甘蔗愈伤组织生长的影响由于本专利技术配制的培养基是无需高温高压，所以在增殖过程中，除了要考虑愈伤组织生长状况外，还要考虑农杆菌的污染问题。表1试验结果表明，本专利技术与常规的农杆菌介导甘蔗转基因方法相比，在愈伤组织生长状况和农杆菌污染率方面都没有差异。如果常规培养基中不添加头孢霉素，只用高温高压的话，其农杆菌污染率达到100 %。表1本专利技术培养基对农杆菌侵染后的甘蔗愈伤组织生长的影响权利要求1.，包括抑菌剂的配制、培养容器消毒、农杆菌转化、培养基配制、共培养、选择培养、筛选培养、壮苗培养和生根培养，其特征在于(1)抑菌剂的配制抑菌剂1号的配制方法在益培隆杀菌剂A瓶药剂中加入20 ml 蒸馏水稀释后与B瓶药剂混合，并用蒸馏水定容到100 本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：阙友雄，林庆良，许莉萍，高世武，陈如凯，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：
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