本发明专利技术公开了一种抗肿瘤血管生成的适体分子，其特征在于其序列为：5′-ACTTCCAGTCTATTCAATTGGGCCCGTCCGTATGGTGGGTGTGCGTGGCCACGAGTTTTAAAAAAAAAAACCAAGCTTTTTTTTGATCATGT-3′及其制备方法。本发明专利技术建立了针对线性DNA适体分子进行环化修饰设计和制备的方法流程，通过改进的RCA反应产生环状DNA适体分子，建立了可高效快速和低成本地制备环状DNA适体的方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及。
技术介绍
适体是功能相当于抗体的DNA或RNA片段，能够对靶分子进行特异性识别和结合， 并有效抑制靶分子的生物学活性。适体的核酸序列信息可通过配体指数级富集系统进化技术(SELEX)筛选得到，适体分子能够采用化学方法大批量低成本合成。DNA适体分子在体外非常稳定，冻干粉状态常温可保存一年以上，因此有很好的药物开发前景。目前适体被认为是最有开发前景的核酸药物之一，其它三种是RNAi、核酶和microRNA。适体分子与细胞外靶分子作用即有效，因此相对必须在细胞内发挥作用的其它三种核酸药物，适体的应用前景更为广泛。目前针对血液疾病、心血管疾病、神经系统疾病、血液系统疾病、肿瘤等疾病的诊断与治疗方面的适体研究已经在进行中，一些适体制剂已经进入临床试验，专门用于治疗黄斑变性的抗血管内皮生成因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)适体药物(Macugen)已经上市。适体药物体内血清稳定性差的特点严重阻碍了其临床应用。由于血液中存在核酸酶，特别是核酸外切酶，使得未加任何修饰的线性DNA或RNA分子的半衰期不到10分钟，适体还未发挥理想的药效作用即被降解。因此要开发适体药物，首先需要考虑的就是如何延长其血液半衰期。当前广泛使用的方式一般有两种一是对组成核酸适体分子的核苷酸进行分子骨架修饰，比如保护性2-位核苷酸修饰(2-F，2-0CH3，LNA，磷酸基团)等。尽管经化学基团修饰的适体分子显示了良好的抗核酸外切酶特性，但是核苷酸骨架的化学修饰有时候影响适体对配体分子的亲合力以及识别的特异性，适体分子代谢后产生的化学修饰核苷酸也可能参与人体核酸的合成，存在潜在的危害。第二种就是对适体分子进行环化修饰。 由于血清中主要核酸酶为核酸外切酶,环化适体分子没有暴露的5'端和3'端，核酸外切酶降解的直接源头被消除，因此适体分子环化修饰可有效延长其血清稳定性。环化适体由于全部采用天然的常用核苷酸，避免了适体代谢后产生有潜在危害产物的风险。目前环化适体的产生，主要是通过体外酶连的方法，以及利用质粒体内产生环化适体，存在效率低，操作复杂的问题。如何既保持经SELEX筛选出的核酸适体分子对配体特异性识别并与之结合的特性，又提高其体内稳定性，还没有系统和成熟的方法。因此，发展一种快速高效和低成本的环状适体制备的方法，对于拓宽核酸适体的应用有着及其重要的意义。本专利技术针对当前适体药物存在的问题，开发了一种能够高效率和低成本的适体环化修饰和制备的方法。
技术实现思路
针对当前适体药物存在的问题，本专利技术建立了针对线性DNA适体分子进行环化修饰设计和制备的方法流程，通过改进的滚环扩增(rolling circle amplification,RCA)反应产生环状DNA适体分子，建立了一种可高效快速和低成本的抗肿瘤血管生成的适体分子环化修饰设计及制备方法流程。DNA适体分子的核酸序列是适体研究中最为重要的部分，核酸序列决定着适体的二级结构以及与配体分子识别的特异性和结合能力，大多数适体如果直接对线性分子进行环化则不能保持其原有构象，从而失去或大大减弱其识别与结合配体分子的能力。本专利技术依据经SELEX筛选出的线性DNA适体序列，经过构象分析和核心序列确定，设计了本专利技术的环状DNA适体序列。DNA适体分子环化技术目前存在着成本高和效率低的问题，本专利技术借鉴RCA方法， 在辅助序列设计、试剂的选择、扩增条件等方面进行改进，建立了一种可快速高效、低成本地产生包含丰富茎环结构的环状适体的技术流程。经过两次RCA反应可使初始环状模板分子增加约10万倍。本专利技术简写说明如下VE5a :经SELEX技术筛选出的可作用于VEGF165的线性适体序列；cVE5a VE5a适体分子序列不加任何改动直接环化后的序列；V5aE+ :加入AT接头序列及酶切位点序列的VE5a线性适体分子；p-V5aE+ V5aE+5/端磷酸化后的序列；V5aE- V5aE+的反向互补序列；cV5aE+ V5aE+的环化适体分子；cV5aE- :V5aE_的环化适体分子，cV5aE+的反向互补序列；LV5aE+ V5aE+的酶连辅助序列；LV5aE- :V5aE_的酶连辅助序列；DV5aE+ cV5aE+的酶切辅助序列；DV5aE- :cV5aE_的酶切辅助序列；exol :核酸外切酶I ;exoIII :核酸外切酶 III ；RV5aE+Pf :双引物RCA反应中正向引物；RV5aE-Pr :双引物RCA反应中反向引物；TFpF :人组织因子(Tissuefactor, TF)特异性扩增正向引物；TFpR :人组织因子(Tissuefactor, TF)特异性扩增反向引物。以上引物和寡核苷酸序列均由生工生物工程(上海)有限公司合成与纯化，无菌去离子水稀释，-20°C保存。为了达到上述目的，本专利技术的技术方案是一种抗肿瘤血管生成的适体分子，其序列为5 ' -ACTTCCAGTCTATTCAATTGGGCCCGTCCGTATGGTGGGTGTGCGTGGCCACGAGTTTTAAAA AAAAAAACCAAGCTTTTTTTTGATCATGT-3 ';该适体分子(V5aE+)在离适体分子与靶分子抗 VEGF165特异结合的核心茎环区域较远的位置插入一个AT接头和一个核酸酶作用位点，其中AT接头中A和T碱基的数目分别是8个；酶作用位点包含DNA连接酶酶连位点以及DNA 内切酶(RsaI)酶切位点，位置在核心茎环区域与AT接头之间，环化修饰的分子可通过环到环循环反应大量制备，环化效率通过实时突光定量RCA检测。一种抗肿瘤血管生成的适体分子的制备方法，包括如下步骤首先对线性适体分子V5aE+进行磷酸化和环化反应，然后进入环到环循环反应；每次环到环循环反应经历两轮反应，每轮反应依次为滚环扩增反应、酶切反应和环化反应。 所述的环化反应使用的酶连辅助序列LV5aE+为51 -CCCAATTGAATAGACTGGAAGTA CATGATCAAAAAAAAGCT-3'；或酶连辅助序列 LV5aE_ 为5' -AGCTTTTTTTTGATCATGTACTTCCA GTCTATTCAATTGGG-3'。所述的滚环扩增反应使用的引物序列即酶连辅助序列LV5aE+为5' -CCCAATTGA ATAGACTGGAAGTACATGATCAAAAAAAAGCT-3'；或酶连辅助序列 LV5aE_ 为5' -AGCTTTTTTTTG ATCATGTACTTCCAGTCTATTCAATTGGG-3'。所述的酶切反应使用的酶切辅助序列DV5aE+为 5 ' -GAATAGACTGGAAGTACATGATC-3或酶切辅助序列 DV5aE_ 5' -GATCATGTACTTCCAGTCTATTC-3'。所述的环化反应条件为将I份已环化的磷酸化线性适体与1-5份酶连辅助序列混合，在Taq DNA连接酶缓冲液(购自New EnglandBiolabs公司，美国)中，95°C孵育5分钟，然后缓慢冷却到室温；加入Taq DNA连接酶(购自New England Biolabs公司，美国), 94°C孵育4分钟；然后按照以下程序完成15个循环94°C 30秒，45°C 5分钟；最本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨会勇，刁勇，林俊生，杨丽，
申请(专利权)人：华侨大学，
类型：发明
国别省市：
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