本发明专利技术公开了一种定量检测6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(MPT-NAG)的检测方法及试剂。本发明专利技术所述检测方法的测定原理为：测定试剂中的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶将MPT-NAG催化分解产生6-甲基-2巯基吡啶(MPT)和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖，反应中生成的MPT在205nm、270nm、340nm处有最大吸收，通过测定37℃反应一段时间后特定波长下溶液的吸光度值，计算出样品中MPT-NAG的含量。本方法所涉及的化学品均无毒、易得，符合发展绿色检测方法的要求，检测灵敏度高，线性、精密度好，结果准确，且操作简便快速，可用于各种类型的分析仪，满足大规模测定样本的要求。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物化学试剂检测领域，具体涉及一种定量检测6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(MPT-NAG)的检测方法和用于该方法的检测试剂。
技术介绍
6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β -D-氨基葡萄糖苷(MPT-NAG)是近年来合成的测定N-乙酰-β -D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)的新底物。以MPT-NAG为主要原材料开发的液体型NAG测定试剂具有稳定、抗干扰能力好、能实现自动化分析等特点，在临床得以广泛应用。MPT-NAG含量的高低显著影响NAG测定试剂的灵敏度，是控制NAG测定试剂批间差不可忽视的实验因素之一。目前实验室测定MPT-NAG含量时均采用高效液相色谱(HPLC)法，该法需要专用大型仪器，需要标准品做对照，检测费时且成本高，检测时还需要使用有毒溶剂甲醇，易造成环境污染。因此，寻求一种操作简便、灵敏度高、结果准确的方法，对MPT-NAG进行定量检测就显得尤为重要。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决上述技术的不足，利用N-乙酰-β -D-氨基葡萄糖苷酶对MPT-NAG的催化分解，通过测定反应一段时间后特定波长下溶液的吸光度值，计算出待测定样品中MPT-NAG浓度。依据该法构建的测定试剂绿色、环保，实现一步法直接测定，测定试剂置于2-8°C环境中可稳定保存12个月，用普通的紫外分光光度计就可以实现检测。本专利技术测定原理为测定试剂中的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶将MPT-NAG催化分解产生6-甲基-2巯基吡啶(MPT)和N-乙酰-β -D-氨基葡萄糖。反应中生成的MPT 205nm,270nm,340nm处有最大吸收，通过测定37°C反应一段时间后特定波长下溶液的吸光度值，计算出样品中MPT-NAG的含量。本专利技术通过以下技术方案实现一种定量检测6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β -D-氨基葡萄糖苷(MPT-NAG)的检测方法，其特征在于包括如下步骤1)配制含有MgCl2、EDTA · 2Na、N-乙酰- β _D_氨基葡萄糖苷酶、聚乙二醇6000、 乙二醇、蔗糖的PH4. 0-5. 0柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液；2)加入含MPT-NAG的待测样品，反应一段时间，试剂中的N-乙酰- β -D-氨基葡萄糖苷酶将MPT-NAG催化分解产生6-甲基-2巯基吡啶(MPT)和N-乙酰-β -D-氨基葡萄糖；3)通过测定特定波长下溶液的吸光度值，计算出待测样品中MPT-NAG的含量。步骤(1)中所述pH4. 0-5. 0柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液的浓度为30-500mmol/L、MgCl2 浓度为 2-20mmol/L、EDTA · 2Na 浓度为 0. 5-10mmol/L、N-乙酰-β -D-氨基葡萄糖苷酶浓度为5-20KU/L、聚乙二醇6000浓度为2-10g/L、乙二醇浓度为20-100ml/L、蔗糖浓度为 5-50g/L。步骤O)中的反应条件为在37°C环境中反应5-lOmin。步骤O)中反应生成的6-甲基-2巯基吡啶(MPT)分别在205nm、270nm、340nm处有最大吸收，尤其是340nm。样品中MPT-NAG的计算公式为样品液MPT-NAG含量(mmol/L)= (Au-A0) XV1X IO3/( ε XV2)，其中Au为样品管反应吸光度值，Atl为同体积的去离子水代替样品所测得的吸光度值,V1为总反应体积，V2为样品体积，ε为特定波长下MPT-NAG的摩尔吸光值。本专利技术的另一个目的是提供一种定量检测6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β -D-氨基葡萄糖苷(MPT-NAG)的检测试剂，其特征在于含有pH4. 0-5. 0柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液中柠檬酸-柠檬酸三钠浓度为30-500mmol/L，MgCl2浓度为2-20mmol/L、 EDTA -2Na浓度为0. 5-10mmol/L、N-乙酰- β -D-氨基葡萄糖苷酶浓度为5-20KU/L、聚乙二醇6000浓度为2-10g/L、乙二醇浓度为20-100ml/L、蔗糖浓度为5_50g/L，待测样品的浓度为 0.005-16. 5g/L。利用本专利技术所述定量检测6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰- β -D-氨基葡萄糖苷 (MPT-NAG)的酶法检测方法，可以精确检测待测样品中含有的6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰- β -D-氨基葡萄糖苷(MPT-NAG)的范围为0. 015-50mmol/L。本专利技术所涉及的化学品均无毒、易得，符合发展绿色检测方法的要求。本检测方法与高效液相(HPLC)法相比较结果见表1。表 权利要求1.一种定量检测6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β -D-氨基葡萄糖苷(MPT-NAG)的检测方法，其特征在于包括如下步骤1)配制含有MgCl2、EDTA· 2Na、N-乙酰- β -D-氨基葡萄糖苷酶、聚乙二醇6000、乙二醇、蔗糖的ΡΗ4. 0-5. 0柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液；2)加入含MPT-NAG的待测样品，反应一段时间，试剂中的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶将MPT-NAG催化分解产生6-甲基-2巯基吡啶(MPT)和N-乙酰-β -D-氨基葡萄糖；3)通过测定特定波长下溶液的吸光度值，计算出待测样品中MPT-NAG的含量。2.根据权利要求1所述的一种定量检测6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(MPT-NAG)的检测方法，其特征在于步骤(1)中所述ρΗ4. 0-5.0柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液的浓度为 30-500mmol/L、MgCl2 浓度为 2-20mmol/L、EDTA *2Na浓度为 0. 5-10mmol/ L、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶浓度为5-20KU/L、聚乙二醇6000浓度为2-10g/L、乙二醇浓度为20-100ml/L、蔗糖浓度为5_50g/L。3.根据权利要求1所述的一种定量检测6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(MPT-NAG)的检测方法，其特征在于步骤O)中的反应条件为在37°C环境中反应 5-10mino4.根据权利要求1所述的一种定量检测6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(MPT-NAG)的检测方法，其特征在于步骤( 反应中生成的6-甲基-2巯基吡啶 (MPT)分别在205nm、270nm、340nm处有最大吸收。5.据权利要求1所述的一种定量检测6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(MPT-NAG)的检测方法，其特征在于样品中MPT-NAG的计算公式为样品液MPT-NAG 含量(mmol/L) = (Au-A0) XV1X IO3/( ε XV2)，其中Au为样品管反应吸光度值，Atl为同体积的去离子水代替样品所测得的吸光度值，V1为总反应体积，V2为样品体积，ε为特定波长下 MPT-NAG的摩尔吸光值。6.一种用于权利要求1-5中任一项所述的检测方法的检测试剂，其特征在于含有 pH4. 0-5. 0柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液中柠檬酸-柠檬酸三钠浓度为30-500mmol/L，MgCl2 浓度为2-20mmol/L、EDTA · 2Na浓度为0. 5-10mmol/L、N-乙酰- β -D-氨基葡萄糖苷酶浓度为5-20KU/L、聚乙二醇6000浓度为2_10g本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：连国军，陶国锋，
申请(专利权)人：上虞市创烨生物有限公司，
类型：发明
国别省市：
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