一种植物水通道蛋白及其编码基因的应用属植物基因工程技术领域，本发明专利技术提供的植物抗逆相关蛋白AcAQP包含由SEQ?ID?NO：2所示的氨基酸序列组成、将SEQ?ID?NO：2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代或缺失或添加且与植物抗逆相关的由SEQ?ID?NO：2衍生的蛋白质；编码基因AcAQP的编码序列如下之一：a.编码序列的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示；b.编码SEQ?ID?NO：2蛋白序列的核苷酸分子；c.与a核苷酸序列具有90％以上同源性且编码蛋白的核苷酸分子；d.与a的核苷酸序列杂交且编码蛋白的核苷酸分子；将AcAQP导入酿酒酵母得到的转基因酿酒酵母，可提升酵母耐干旱耐盐碱能力。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属植物基因工程
，具体涉及运用酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae INVScl菌株表达一种与植物抗逆相关的蛋白AcAQP。
技术介绍
自然界中存在多种如盐、碱、高温、低温、干旱、病虫害等多种生物和非生物胁迫， 限制了作物的生长发育，从而影响作物产量直接威胁到粮食安全，因此，将抗逆境胁迫的基因转入作物中进行分子育种改良作物性状引起了科研工作者的兴趣。而克隆逆境相关基因及其功能的研究能够为通过基因工程进行植物抗逆育种提供有价值的信息和材料。但是， 当前很多研究主要集中在草本植物，很少对木本植物特别是盐生木本植物进行分子遗传学的研究。木本植物和草本植物应对生物和非生物胁迫时在结构、生长、发育以及生理等方面存在差异性，因此克隆和研究木本植物中与抗逆相关的基因能够为通过基因工程提高作物对生物和非生物胁迫的耐受力提供更多的候选基因。四翅滨藜(Atriplex canescensNute)是藜科，滨藜属木本植物，是干旱、 半干旱地区的典型植物，在年降雨量180mm以上，年均气温5°C左右，极端最低温度_40°C的干旱、半干旱荒漠、盐碱地生长良好，种源产地海拔2377m，人工栽植区已达3150m。据报道四翅滨藜被有些国家称为“生物脱盐器”，种6. 07亩四翅滨藜，一年能从土壤中吸收It以上的盐分，是荒漠、半荒漠山旱地极有价值的优良饲料灌木，高产优质、富含营养，枝叶含12% 以上的粗蛋白，生物量达15t/hm2，同时有积累硒的能力，在美国广泛用于路坡固定和水土保持，但主要还是用于牧场改良。近几年先后在我国甘肃、青海、新疆、宁夏等地进行了区域性引种栽培试验，显示了极强的耐干旱、耐低温、贫瘠、抗盐碱等优良特性。酿酒酵母菌&iccharomyces cerevisiae不仅具有生长快、容易培养和易于遗传操作等优点，而且具有典型真核系统的特性，具有糖基化、二硫键形成以及蛋白质折叠等翻译后加工等过程，其表达模式与植物表达模式更为接近，所以用酵母筛选植物抗逆基因具有原核表达系统不可替代的优越性。采用酵母突变体筛选植物的不同cDNA文库来鉴定和挖掘新基因的方法已经广泛应用于植物功能基因的研究。用酵母的2种不同氨基酸转运缺陷突变体筛选拟南芥cDNA文库，Frommer等和Hsu等(1993年)成功地克隆到相应的编码相同氨基酸透过酶的NAT2/AAP1。酵母表达系统还被广泛地应用到植物耐盐基因功能研究中，Yamada等(2002年)利用酵母表达体系验证了丙二烯环化氧化酶(AOC)基因大大增强转化子的耐盐性，从而表明AOC基因在真核表达系统中增强抗盐胁迫的功能。唐玉林等 (2007年)利用酵母表达系统研究大豆SALI3-2蛋白功能，将大豆SAL 13-2蛋白cDNA及其缺失片段构建到酵母表达载体PYES2上，并转化酵母菌INV&1，检测酵母重组子在胁迫条件下的生长状况，结果表明，SALI3-2基因可明显提高酵母转化子的耐盐能力。酿酒酵母菌株INVkl (基因型为MATa his3Dl leu2 trpl-289 ura3_5W是一种二倍体，并且生长迅速的理想酵母表达菌株，该菌株是人工改造的尿嘧啶营养缺陷型菌株，运用SC-U培养基筛选转化子，假阳性率低，能够保证转化效率。水通道蛋白，也称水孔蛋白(简称AQP)，普遍存在于动物，植物及微生物中。到目前为止，植物中已发现了多种水通道蛋白水通道蛋白具有MIP家族结构的典型特征，序列亲水性分析表明，水通道蛋白具有由5个短环(loop)相连的6个跨膜α螺旋及伸入细胞质的N端和C端组成。水通道蛋白含有特征信号序列GGGANXXXXGY和TGI/TNPARSI/FGAAI/ VI/VF/YN。水通道蛋白的一级结构呈现出内部同源性，也就是说它的N端蛋白与C端蛋白具有同源性，这被推测为是基因内部扩增而成在平衡细胞水分的过程中，可阻止因干旱、盐害、高温等胁迫下的水分丢失，降低外界环境胁迫的渗透伤害。在植物发育过程中水通道参与多种生理过程包括气孔的关闭，器官运动，细胞伸长以及细胞分裂，而且它还在植物种子萌发，韧皮部的装卸及逆境应答等过程中调节水分跨膜快速流动，因此植物水孔蛋白在植物体内形成水选择性运输通道，介导胞内或胞间的水分跨膜运输，调节植物体内的水分快速平衡，对于提高植物抗盐及抗旱性可能发挥着重要作用大量的研究表明，在植物受到干早或者土壤盐渍化时，植物体就处于一种渗透胁迫的状态，而植物AQPs具有防止渗透伤害、缓冲渗透振荡、参与渗透胁迫响应等作用，调节体内外水分平衡，维持植物的正常生长发育状况，为植物抵御环境胁迫起着重要的作用。其中，转化pYES-AcAQP重组载体的酵母INVkl菌株在抗干旱和盐碱胁迫中表现出较强抗性，在众多的研究中，还未看到有关含AQP功能域的四翅滨藜基因在酵母抗逆和植物的抗逆生理功能方面的相关报道。
技术实现思路
本专利技术采用盐生灌木植物四翅滨藜(Atriplex canescens)作为研究材料，通过构建低温(-10°C )和盐GOOmM NaCl)胁迫下四翅滨藜的全长运用hvitrogen公司 SuperScript Full-LengthcDNA Library Construction Kit 构建全长 cDNA 文库，并通过 Gateway技术LR重组到酵母表达载体pYES_DEST52中，混合质粒转化酵母菌株INVkl，通过多种模拟逆境胁迫(盐碱、冻害、高温、SOS胁迫、干旱胁迫)筛选出与逆境胁迫相关的基因，为今后利用耐盐碱、干旱、冻害、SOS胁迫基因获得抗相应逆境胁迫的转基因农作物和林木奠定基础，同时也为四翅滨藜耐盐碱和耐低温分子机制研究提供依据。本专利技术使用酵母表达载体pYES_DEST52(购自^witrogen公司)，插入本专利技术 AcAQP蛋白核苷酸编码序列以及得到重组表达载体pYES-AcAQP，它除了携带有AcAQP蛋白核苷酸编码序列外，还有T7启动子、GALl启动子、CYCl终止转录信号、URA3基因、fl复制基因、PUC复制基因、酵母2 μ复制序列、氨苄青霉素抗性基因、attRl和attR2用于LR重组的重组位点、致死基因ccdB用于逆向筛选转化子、氯霉素抗性基因用于对阳性转化子的双重筛选、Vkpitope便于重组后蛋白表达检测、6xHis Tag用于重组基因纯化，以及为外源蛋白高效表达所需的各种调控元件。从四翅滨藜全长uncut cDNA文库中EST测序得到AcAQP(Atriplex canescens Aquaporin)基因，并通过Gateway技术LR重组到酵母表达载体pYES_DEST52中。AcAQP基因由1243个碱基组成，含有一个完整的开放阅读框架(Open Reading Frame) 930bp，同时还提供5，-UTR和3，-UTR序列，AcAQP为序列表中的SEQ ID NO 1序列。开放读码框的起始密码子为ATG，终止密码子为TAG。本专利技术的一个目的是提供含水通道蛋白功能域的四翅滨藜中与植物抗逆相关的蛋白及其编码基因，并进行应用。本专利技术提供一种植物抗逆相关蛋白耐Na2C03、NaHCO3、低温和干旱等胁迫，名称为 AcAQP (Atriplex canescens Aquap本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：潘洪玉，余刚，张世宏，刘金亮，陈宣明，孙新华，贾承国，李桂华，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：
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