一种植物核酸酶及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种植物核酸酶及其编码基因与应用。该植物核酸酶，是如下（ａ）或（ｂ）的蛋白质：（ａ）由序列表中序列３所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（ｂ）将序列３的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和／或缺失和／或添加且具有核酸酶活性的由序列３衍生的蛋白质。本发明专利技术的核酸酶可用于降解ＤＮＡ，如超螺旋ＤＮＡ、双链ＤＮＡ和单链ＤＮＡ中的任意一种，没有切割特异性，可以作为去除ＤＮＡ的广谱酶。本发明专利技术的核酸酶耐热，在较高温度下具有酶活性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程领域，涉及一种核酸酶及其编码基因与应用。
技术介绍
核酸分解的第一步是水解核苷酸之间的磷酸二酯键，在高等动植物中都有作用 于磷酸二酯键的核酸酶。不同来源的核酸酶，其专一性、作用方式都有所不同。有 些核酸酶只能作用于RNA，称为核糖核酸酶(RNase)，有些核酸酶只能作用于DNA， 称为脱氧核糖核酸酶(DNase)，有些核酸酶专一性较低，既能作用于RNA也能作 用于DNA，因此统称为核酸酶(nuclease)。植物中DNase参与衰老、发育过程中的程序性死亡(PCD)、超敏反应等，很 多与DNA的修复相关。在植物PCD过程中有DNA的损伤和降解，已经陆续检测到和 克隆出了该过程有关的DNase。在西红柿的叶衰老过程中检测到了两个nuclease。 百日草中克隆到ZEN1，认为ZEN1是直接参与管状分子PCD的DNase。在小麦的糊粉 层细胞凋亡中发现了定位在核内的GA诱导的nuclease。从拟南芥中克隆到DNase BFN1，可能和叶的衰老过程有关。DNase可以根据依赖离子的不同分类，也可以根 据对底物的偏好分类。拟南芥的d基因在2000年被克隆，已证明CAN有依赖钙离子的DNase活性， 但是缺乏深入的功能分析。CAN与葡萄球菌细胞外核酸酶类似，有一个SNc结构域， 它的酶活性可被锌离子抑制，在细菌中己经发现很多与葡萄球菌细胞外核酸酶同源 的基因，例如，幼J'《e"a /7e;^eW中pSa质粒上的nuc基因，大肠杆菌中RP4质 粒上的parB基因。高等植物中第一个与葡萄球菌同源的DNase基因在紫堇属(&iTO^isse邵erw e/^)中发现，植物中其他同源的基因陆续被克隆，现已经 从烟草、杨树、水稻等多种植物中找到该类基因。虽然已克隆到很多DNase，但它们在植物PCD过程中所起的作用，所处的地位 尚不明确，与动物相比，植物PCD过程的研究仍然处于起步阶段。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种核酸酶及其编码基因。本专利技术所提供的核酸酶，名称为CsCaN，来源于黄瓜，是如下(a)或(b)的蛋白质(a) 由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b) 将序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有核酸酶活性的由序列3衍生的蛋白质。序列表中的序列3由334个氨基酸残基组成，自序列3的氨基末端第220-330位氨基酸残基是保守的SNc结构域。所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指在序列3的SNc结构域外进行取代和/或缺失和/或添加。为了使(a)中的CsCaN便于纯化，可在由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表l所示的标签。表l标签的序列标签残基序列Poly-Arg5-6 (通常为5个)RRRRRPoly-His2-10 (通常为6个)HH朋HHFLAG8DYKDDDDKStrep-tag II8WSHPQFEKc—myc10EQKLISEEDL上述(b)中的CsCaN可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的CsCaN的编码基因可通过将序列表中序列2自5'端第1至1005位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。上述核酸酶的编码基因也属于本专利技术的保护范围。所述核酸酶的编码基因具体可为如下l)或2)或3)的基因1) 其核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子；2) 在严格条件下与l)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；3) 与序列表中序列2限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。上述严格条件可为在6XSSC， 0.5y。SDS的溶液中，在65。C下杂交，然后用2XSSC, 0. 1% SDS和1 XSSC, 0. 1% SDS各洗膜一次。4序列表中的序列2由1005个脱氧核糖核苷酸组成，自5'末端的第1至1005位脱氧核糖核苷酸为"C3W的开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)，自5，端的第l至3位脱氧核糖核苷酸为&Cs7V的起始密码子ATG，自5，端的第1003至1005位脱氧核糖核苷酸为6^^3#的终止密码子TAA。含有CsCaN的上述任一种编码基因的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌均属于本专利技术的保护范围。所述重组表达载体可为在pET28a (+)的^3/zin和7fotl酶切位点间插入序列表中序列2所示的核苷酸序列得到的重组表达载体pET28a-^&vV。所述重组表达载体还可为在表达载体Pmal载体的ife/21和&7I酶切位点间插入序列表中序列2所示的核苷酸序列得到的重组表达载体Pmal-本专利技术提供的核酸酶可用于降解DNA，如超螺旋DNA、双链DNA和单链DNA中的任意一种，没有切割特异性，可以作为去除DNA的广谱酶。本专利技术提供的核酸酶耐热，在较高温度下具有酶活性。以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。附图说明图1为CsCaN胶内酶活检测的电泳2为CsCaN试管内酶活检测的电泳3为CsCaN钙离子依赖酶活检测的电泳4为CsCaN耐热酶活检测的电泳图具体实施例方式下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例1、黄瓜核酸酶CsCaN的筛选及其cDNA的克隆因为黄瓜雌花雄蕊在特定的时期开始出现花药特异的DNA损伤，并且检测到该过程中有DNase活性物质存在，推测可能DNase导致DNA的损伤的发生，从而引起雄蕊原基的滞育，产生单性花，那么这个导致DNA损伤的DNase基因就是一个关键的执行分子，很值得研究。在黄瓜雌花雄蕊的发育过程中， 一定有很多基因参与这个发育调控的过程，所以通过克隆发育调控的基因，解析这一过程。通过抑制消减杂交找到差异表达的基因，得到一系列基因，然后再筛选符合预期的基因，找到DNase的EST， EST序列如序列表中的序列1所示。根据EST序列设计引物如下3， RACE引物Nuclease3， racel 5， GCTGAGGCTTGG織ACGGAGAA 3，Nuclease3' race2 5， CAGACGCTGCCAGTTGATGCC 3，Nuclease3， race3 5， AAGACAATCACGGATGCTGGTTACA 3，5' Race引物Nuclease 5， race3 3， AACCGACTCCGAACCTTCTGCCTC 5，Nuclease 5， race2 3' CTGCGACGGTCAACTACGGTTTCG 5'Nuclease 5' racel 3' TCGTGTAGTGTGGGCTCTCTCAGGAG 5'反转录引物Nuclease 5， raceRT 3， TTACTCCTCCMGAA 5，利用带oligo dT的反转录引物反转录合成第一链cDNA，用通用引物和上面的三个PCR引物顺序进行嵌套PCK，对最终得到的产物进行测序，得到全长的CsCaNcDNA序列。PCR流程见CLONTHCH公司SMART-RACE试剂盒。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白，是如下（ａ）或（ｂ）的蛋白质：　（ａ）由序列表中序列３所示的氨基酸序列组成的蛋白质；　（ｂ）将序列３的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和／或缺失和／或添加且具有核酸酶活性的由序列３衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：顾海涛，白书农，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]