本发明专利技术属于生物技术领域，特别公开了一种利用转基因技术提高植物钙含量的方法。本发明专利技术的目的在于提供盐地碱蓬Ca2+/H+逆向转运蛋白或其编码基因和拟南芥质膜钙通道蛋白或其基因，将两者一起进行遗传转化，用于提高植物钙含量，而对植物的正常生长无影响。本发明专利技术操作简单，能够提高钙运输系统活性、保证胞质钙稳衡态，对植物的正常生长无影响，便于广泛推广应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，特别涉及一种。
技术介绍
钙是植物正常生长发育不可缺少的大量元素，增加植物中钙含量有利于提高植物产量、抵抗环境胁迫及延长果实保存时间；另外，富含钙的食用植物对于改善人或动物膳食钙营养和防治缺钙症具有重大意义。目前，在农业生产中主要通过施加钙肥来增加植物含钙量，此补钙方法会造成生产成本的提高，而且植物可食用部分的钙积累效果与植物本身的遗传特性、施钙时机和方法有关；另外，长期来看大量的未被吸收的钙肥积累在土壤中，易造成土壤次生盐碱化，影响植物正常生长，因此依赖育种和分子技术增加植物本身钙吸收和积累能力，可克服钙肥使用的不足，应用前景较好。 植物对钙的积累主要取决于植物细胞膜钙运输系统=Ca2+通道和Ca2+主动运输系统。Ca2+可通过Ca2+通道进入胞质作为信号分子调控植物生长或对外界胁迫的反应，但胞质中并不能长时间维持较高浓度Ca2+，否则与胞质内无机磷酸盐形成沉淀而影响细胞正常的生理活动。故胞质中增加的钙多数又会通过质膜及细胞器膜上Ca2+主动运输系统运入细胞间隙和细胞器积累起来，完成钙的储存。其中液泡因体积大而作为主要的钙储存场所。细胞胞质钙进入液泡主要依赖于液泡膜的Ca2+主动运输系统一Ca2+AT antiporter (Ca2VH+逆转运蛋白)和Ca2+-ATPase,并以 Ca2VH+ antiporter承载能力最大。Ca2+/H+ antiporter的基因已从多种植物中克隆，其产物的活性差别较大。Park等人通过过量表达修饰的拟南芥液泡膜Ca2+/H+ antiporter基因 CAXl (cation exchanger)明显的提高了植株的含钙量，但同时也使植株在正常营养条件下出现了缺钙症状。分析原因主要是液泡膜Ca2+/H+ antiporter活性的提高加速了进入胞质的钙流入液泡，使得钙在胞质中难以行使正常的信号转导等功能，破坏了植株的生长及抗逆性。以牺牲植株正常生长和抗性为代价来获得高钙作物在农业生产中并不可取。到目前为止，几乎所有关于利用分子生物学手段提高作物含钙量的研究主要集中在液泡膜钙主动运输体系上，少有从质膜钙通道和液泡钙主动运输体两方面研究的。最近， Nakagawa等人利用酵母钙通道缺失突变体从拟南芥中克隆了一条牵张激活型钙通道基因 Mcal,其ORF为1266 bp，并对该基因表达特性做了初步的探索，指出该表达产物定位于质膜上，负责将胞外钙运输到细胞质中，属于钙内流通道。而只过量表达此基因会使钙积累在胞质中引起细胞钙中毒，仍然不利于植株生长。
技术实现思路
本专利技术为了弥补现有技术的不足，提供了一种提高钙运输系统活性、保证胞质钙稳衡态的。本专利技术是通过如下技术方案实现的一种，主要包括如下步骤 (1)以引物1和2为引物，用盐地碱蓬RNA合成的CDNA为模板，通过PCR扩增出条带，得到公以Z/基因，经测序其核苷酸序列如Genbank号AY518204所示，其中，上游引物 1 为 5，-GTCTCGAG CCATATCATCAGCTAGTC-3，，下游引物 2 为 5，-CTGGATCC TGGTCATTTGATGCTTTAT-3，；(2)以引物3和4为引物，用拟南芥RNA合成的cDNA为模板，通过PCR扩增出条带，得到 Mcal基因，经测序该核苷酸序列如Genbank号AB196960所示，其中，上游其中引物3为5’-G TCCCGGGTTCTCATCTCTGCCTCTGG-3，，下游引物 4 为 5，-CTGAATTC CACACAACACAAATTGCTG-3，；(3)将基因插入到含有35S启动子的中间载体质粒pJIT163Smal,EcoRl位点， 得到重组质粒pJIT163-ifca7 ；从重组质粒pJIT163_ifca7上利用幻I，SphI将2 X 35S promoter-Mcal-poly (A)切下，定向克隆入重组质粒pCAMBIA1300的幻7/ 1，位点， 得到重组质粒pCAMBIA1300-ifca7 ；(4)将5 以Z/基因插入到含有35S启动子的中间载体pRTlOl损oI，fe HI位点， 得到重组质粒pRTlOl-公以Z/。随后，从重组质粒pRT101-‘&以Z/上利用将35S promoter-公以Z/-poly (A)切下，插入进入质粒pCAMBIA1300_ifca7位点，得到双元表达载体 pCMBIA1300-ifca7 -SsCAXl ；(5)利用农杆菌介导的叶盘转化法，对植物的子叶进行菌液侵染转化，侵染后的子叶放置于含有潮霉素的分化培养基上培养，通过潮霉素的筛选，将具有抗性的再生苗转移到温室培养，并对再生苗进行PCR检测，最终确定转化阳性苗。本专利技术的目的在于提供盐地碱蓬Ca2+/H+逆向转运蛋白或其编码基因和拟南芥质膜钙通道蛋白或其基因，将两者一起进行遗传转化，用于提高植物钙含量，而对植物的正常生长无影响。本专利技术认为，要提高作物钙积累能力不能只考虑提高细胞内钙储存场所的钙输入力，即液泡膜钙主动运输系统活性，还要考虑提高细胞外钙进入细胞的能力，即质膜钙通道活性，这样可从整体上提高钙运输系统的活性而又不影响胞质钙稳衡态，对作物钙的积累及生长都是有利的。所述5 以Z/基因编码氨基酸序列如Genbank号AAR99078所示，McaJ基因编码氨基酸序列如Genbank号BAF46389所示。步骤(1)和(2)中，通过PCR扩增出的条带为1.6 kb。步骤(5)中，所述植物为番茄。本专利技术操作简单，能够提高钙运输系统活性，又能保证胞质钙稳衡态，对植物的正常生长无影响，便于广泛推广应用。附图说明下面结合附图对本专利技术作进一步的说明。图1为RT-PCR克隆盐地碱蓬基因5 以Z/ (A)及拟南芥基因(B)图； 图2为双元表达载体pCMBIA1300-ifca7 -SsCAXl示意图3为RT-PCR检测转基因番茄植株5 以Z/基因表达图； 图4为RT-PCR检测转基因番茄植株基因表达图； 图5为野生型和转基因番茄植株相对生长速率对比图； 图6为野生型和转基因番茄果实Ca2+含量对比图。具体实施例方式附图为本专利技术的一种具体实施例。但本专利技术并不限于以下实施例。下列实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。实施例1 基因的获得SsCAXl基因是以下述引物1和2为引物，用盐地碱蓬RNA合成的cDNA为模板，通过PCR 扩增出约1. 6 kb的条带(图1A)，经测序核苷酸序列如Genbank号为AY518204的基因，该基因编码氨基酸序列如Genbank号为AAR99078所示的蛋白。引物 1 (上游)5，-GTCTCGAG CCATATCATCAGCTAGTC-3， 引物 2 (下游)5，-CTGGATCC TGGTCATTTGATGCTTTAT-3，Mcal基因是以下述引物3和4为引物，用拟南芥RNA合成的cDNA为模板，通过PCR扩增出约1. 6 kb的条带(图1B)，经测序核苷酸序列如Genbank号为AB196960的基因，该基因编码氨基酸序列如Genbank号为BAF46389所示的蛋白。引物 3 (上游)5，-GTCCCGGGTTCTCATCTCTGCCTCTGG-3， 引物 4 (下游)5，-CTGAATT本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种利用转基因技术提高植物钙含量的方法，其特征为，主要包括如下步骤：（１）以引物１和２为引物，用盐地碱蓬ＲＮＡ合成的ｃＤＮＡ为模板，通过ＰＣＲ扩增出条带，得到ＳｓＣＡＸ１基因，经测序其核苷酸序列如Ｇｅｎｂａｎｋ号ＡＹ５１８２０４所示，其中，上游引物１为５’－ＧＴＣＴＣＧＡＧ ＣＣＡＴＡＴＣＡＴＣＡＧＣＴＡＧＴＣ－３’，下游引物２为５’－ＣＴＧＧＡＴＣＣ ＴＧＧＴＣＡＴＴＴＧＡＴＧＣＴＴＴＡＴ－３’；（２）以引物３和４为引物，用拟南芥ＲＮＡ合成的ｃＤＮＡ为模板，通过ＰＣＲ扩增出条带，得到Ｍｃａ１基因，经测序该核苷酸序列如Ｇｅｎｂａｎｋ号ＡＢ１９６９６０所示，其中，上游其中引物３为５’－ＧＴＣＣＣＧＧＧＴＴＣＴＣＡＴＣＴＣＴＧＣＣＴＣＴＧＧ－３’，下游引物４为５’－ＣＴＧＡＡＴＴＣ ＣＡＣＡＣＡＡＣＡＣＡＡＡＴＴＧＣＴＧ－３’；（３）将Ｍｃａ１基因插入到含有３５Ｓ启动子的中间载体质粒ｐＪＩＴ１６３ ＳｍａＩ，ＥｃｏＲＩ位点，得到重组质粒ｐＪＩＴ１６３－Ｍｃａ１；从重组质粒ｐＪＩＴ１６３－Ｍｃａ１上利用ＫｐｎＩ，ＳｐｈＩ将２×３５Ｓ ｐｒｏｍｏｔｅｒ－Ｍｃａ１－ｐｏｌｙ（Ａ） 切下， 定向克隆入重组质粒ｐＣＡＭＢＩＡ１３００的ＫｐｎＩ，ＳｐｈＩ位点，得到重组质粒ｐＣＡＭＢＩＡ１３００－Ｍｃａ１；（４）将ＳｓＣＡＸ１基因插入到含有３５Ｓ启动子的中间载体ｐＲＴ１０１ ＸｈｏＩ，ＢａｍＨＩ位点，得到重组质粒ｐＲＴ１０１－ＳｓＣＡＸ１。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：韩宁，赵新杰，何熹，毛德奖，
申请(专利权)人：山东轻工业学院，
类型：发明
国别省市：88
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