本发明专利技术公开了一种利用苜蓿作为生物反应器生产鸡β抗菌肽Gal-3的方法，属于植物转基因技术领域。本发明专利技术所述的含重组鸡β抗菌肽Gal-3的植物表达载体，将优化的β-Gal-3基因替换植物表达载体pCAMBIA3301上，获得含重组鸡β抗菌肽Gal-3的植物表达载体pCAMBIA330-Gal-3；一种利用苜蓿作为生物反应器生产鸡β抗菌肽Gal-3的方法，通过种植含重组鸡β抗菌肽Gal-3的转基因苜蓿植株，生产鸡β抗菌肽Gal-3。本发明专利技术所述的含重组鸡β抗菌肽Gal-3的转基因苜蓿植株可作为饲料添加剂应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物转基因
，特别涉及一种利用苜蓿作为生物反应器生产鸡β抗菌肽Gal-3的方法。
技术介绍
抗微生物肽(antimicrobial peptides，AMPs)，又称抗菌肽(antibacterial peptides；ABPs)或肽抗生素(peptide antibiotics)，是广泛存在于动物、植物以及微生物体内的一类具有防卫功能的小分子活性肽，具有先天免疫功能，能够对侵入体内的细菌、真菌、病毒及原虫等病原物产生抑制生长和灭活的作用。鸡β抗菌肽的研究始于1994年，Harwig等和Evans等在鸡的白细胞发现4种抗菌肽，命名为“gallinacins”(Gal-1、Gal-2、Gal-3和Gal-1α)。鸡β抗菌肽不单具有抗细菌、霉菌、病毒、螺旋体活性，还具有抗肿瘤细胞毒性的功能，并且参与了内源免疫和适应性免疫。由于禽类异嗜细胞没有氧化机制，所以β防御素在禽类先天免疫方面发挥着更重要的作用。氧化机制涉及超氧化离子、过氧化氢和髓过氧化物酶的作用，而非氧化机制仅由少数几种酶、阳离子蛋白质和多肽完成。禽类异嗜细胞没有超氧化离子和髓过氧化物酶，它们更多地依赖非氧化机制发挥作用，包括溶菌酶、阳离子蛋白质和多肽的作用。鸡β抗菌肽就是一种阳离子多肽，所以说它是禽类的重要免疫因子。豆科植物是人畜主要的植物蛋白质来源，紫花苜蓿是一种优良的豆科牧草，素有“牧草之王”的美称，其适宜种植的范围广泛，能够耐受多种胁迫，且同时兼具生物量大、再生性强、可多次收获等特质，因此是进行植物生物反应器转基因研究与生产的理想受体材料。
技术实现思路
为克服现有技术中存在的缺点与不足，本专利技术的首要目的在于提供一种含重组鸡β抗菌肽Gal-3的植物表达载体。本专利技术的另一目的在于提供一种含重组鸡β抗菌肽Gal-3的转基因苜蓿的制备方法。本专利技术的另一目的在于提供上述制备方法获得的含重组鸡β抗菌肽Gal-3的转基因苜蓿植株。本专利技术的另一目的在于提供一种利用苜蓿作为生物反应器生产鸡β抗菌肽Gal-3的方法。本专利技术的再一目的在于提供上述的含重组鸡β抗菌肽Gal-3的转基因苜蓿植株在饲料添加剂中的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种含重组鸡β抗菌肽Gal-3的植物表达载体，将编码氨基酸按照紫花苜蓿密码子偏好性进行优化的β-Gal-3基因替换植物表达载体pCAMBIA3301上NcoI和BstEII之间的GUS基因，获得含重组鸡β抗菌肽Gal-3的植物表达载体pCAMBIA330-Gal-3；所述的编码氨基酸按照紫花苜蓿密码子偏好性进行优化的β-Gal-3基因的基因序列如SEQ ID NO.1所示；其编码的氨基酸的序列如SEQ ID NO.2所示。一种含重组鸡β抗菌肽Gal-3的转基因苜蓿的制备方法，具体步骤为通过农杆菌介导的遗传转化方法，将权利要求1所述的含重组鸡β抗菌肽Gal-3的植物表达载体pCAMBIA330-Gal-3的T-DNA区域导入紫花苜蓿的叶片，然后在筛选/再生培养基上筛选，获得抗性再生的含重组鸡β抗菌肽Gal-3的转基因苜蓿植株。所述的筛选/再生培养基的配方为：MS培养基4.74g/L，蔗糖30g/L，水解酪蛋白2g/L，2,4-D 2.00mg/L，KT 0.25mg/L，125mg/L cef，125mg/L carb，1.5mg/L basta，pH＝5.8，琼脂粉8g/L。一种含重组鸡β抗菌肽Gal-3的转基因苜蓿植株由上述的制备方法获得。一种利用苜蓿作为生物反应器生产鸡β抗菌肽Gal-3的方法，通过种植上述的含重组鸡β抗菌肽Gal-3的转基因苜蓿植株，生产鸡β抗菌肽Gal-3，获得含鸡β抗菌肽Gal-3的苜蓿。上述获得的含重组鸡β抗菌肽Gal-3的转基因苜蓿植株作为饲料添加剂应用。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：本专利技术利用紫花苜蓿作为生物反应器生产鸡β抗菌肽Gal-3的方法，利用农杆菌介导的紫花苜蓿遗传转化法把载体pCAMBIA330-Gal-3的T-DNA区域导入紫花苜蓿的叶片，并对获得的3142株转基因植株进行筛选与鉴定，最终获得2株单拷贝且高表达植株，经Elisa鉴定其表达的鸡β抗菌肽Gal-3约占可溶性总蛋白的0.17％和0.26％。经截留分子量为3K和10k的聚醚砜膜超滤离心后获得了分子量约为8KDa的鸡β抗菌肽Gal-3，体外抗菌活性鉴定表明其能够显著抑制金色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、伤寒沙门氏菌生长。将转β-Gal-3基因的紫花苜蓿作为食料添加剂饲喂小鼠，其平均体重较饲喂非转基因的的紫花苜蓿作为食料添加剂的小鼠明显增高，但肠道菌群无明显变化。附图说明图1是植物表达载体pCAMBIA330-Gal-3的结构图。图2是农杆菌介导的紫花苜蓿遗传转化流程图；其中，A为预培养，B为愈伤组织的侵染，C为胚状体的筛选，D为分化培养，E为生根培养。图3是紫花苜蓿转基因植株的southern杂交结果图；其中，M为trans15K DNA分子量，+为阳性质粒，-为阴性植株，1为转化事件A91，2为转化事件A375，3，为转化事件C19，4为转化事件D57，5为转化事件E245。图4是单拷贝紫花苜蓿转基因植株的蛋白检测结果图；其中，M为Blue Plus II蛋白标准，-为阴性植株，1为转化事件A91，2为转化事件A375，3，为转化事件C19，4为转化事件D57，5为转化事件E245。图5是紫花苜蓿转β-Gal-3基因植株抑菌活性实验结果图；其中，A为紫花苜蓿生产的鸡β抗菌肽Gal-3对金色葡萄球菌的抑制效果；B为紫花苜蓿生产的鸡β抗菌肽Gal-3对大肠埃希氏菌的抑制效果；C为紫花苜蓿生产的鸡β抗菌肽Gal-3对伤寒沙门氏菌的抑制效果。图6是紫花苜蓿表达的鸡β抗菌肽Gal-3对小鼠肠道菌群的影响图。具体实施方式下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。实施例1：植物表达载体pCAMBIA330-Gal-3的构建根据紫花苜蓿密码子偏好性在保持氨基酸序列(见序列表SEQ ID NO.2)不发生改变的前提下进行基因序列的优化设计，获得SEQ ID NO.1所示的金银序列，并在基因两端添加便于进行载体构建的酶切位点(NcoI和BstEII)，该片段经NcoI和BstEII双酶切后与用相同酶切的pCAMBIA3301质粒所释放的大片段进行连接。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞后本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种含重组鸡β抗菌肽Gal‑3的植物表达载体，其特征在于：将编码氨基酸按照紫花苜蓿密码子偏好性进行优化的β‑Gal‑3基因替换植物表达载体pCAMBIA3301上NcoI和BstEII之间的GUS基因，获得含重组鸡β抗菌肽Gal‑3的植物表达载体pCAMBIA330‑Gal‑3；所述的编码氨基酸按照紫花苜蓿密码子偏好性进行优化的β‑Gal‑3基因的基因序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种含重组鸡β抗菌肽Gal-3的植物表达载体，其特征在于：将编码氨基
酸按照紫花苜蓿密码子偏好性进行优化的β-Gal-3基因替换植物表达载体
pCAMBIA3301上NcoI和BstEII之间的GUS基因，获得含重组鸡β抗菌肽Gal-3的植
物表达载体pCAMBIA330-Gal-3；
所述的编码氨基酸按照紫花苜蓿密码子偏好性进行优化的β-Gal-3基因的基
因序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种含重组鸡β抗菌肽Gal-3的转基因苜蓿的制备方法，其特征在于：具
体步骤为通过农杆菌介导的遗传转化方法，将权利要求1所述的含重组鸡β抗
菌肽Gal-3的植物表达载体pCAMBIA330-Gal-3的T-DNA区域导入紫花苜蓿的叶
片，然后在筛选/再生培养基上筛选，获得抗性再生的含重组鸡β抗菌肽Gal-3
的转基因苜蓿植株。
3.根...
【专利技术属性】
技术研发人员：李校堃，王云鹏，金立波，许诺，刘艳芝，马瑞，马建，
申请(专利权)人：长春格鲁斯特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：吉林;22
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