本发明专利技术根据siRNA设计原理，针对PAR-1基因的mRNA序列设计了8对siRNA，该8对siRNA可以用于抑制PAR-1基因表达的siRNA，由于PAR-1基因的表达水平与肝纤维化密切相关，抑制PAR-1基因的表达就能有效延缓甚至阻断肝纤维化的病理进程，达到治疗肝硬化的目的。上述8对siRNA序列可用于制备治疗肝纤维化的药物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及抑制PAR-I (蛋白酶激活受体-1)基因表达的SiRNA(小分子干扰RNA) 及其应用。
技术介绍
几乎所有肝病均具有炎症坏死，而只要有炎症坏死，肝纤维化即发生。肝纤维化的不断发展，引起肝小叶结构改建和假小叶形成，导致肝硬化；纤维组织压迫血管，引起门脉高压和肝缺血，进而加剧肝细胞坏死和炎症，如此形成恶性循环。因此，阻断肝纤维化的发生和发展，对防治肝硬化具有重要意义。而且我国肝病发病率是比较高的国家之一，所以寻找有效途径抑制肝纤维化，有相当重要的意义。肝纤维化和它导致的最后阶段的肝硬化，通常是由病毒感染，过度使用损害肝脏的药物，代谢系统疾病，和遗传因素引起的。肝纤维化的病理进程，实际上是正常的肝组织被疤痕类似的胶原蛋白代替，导致肝功能的丧失，过去认为这个过程是一个不可逆的过程， 直到最近才认为这个过程在早期是可以挽救的。根据目前的研究，表明星状细胞在这个过程中起了关键作用。正常的肝脏中，星状细胞大约占肝体积的1.4%，相当于每100个肝细胞中大约有3. 6-6个星状细胞。纤维化的过程实际上是来自于门静脉和窦周的α平滑肌细胞骨架阳性的肌纤维母细胞产生和增殖的过程。虽然这种细胞有不止一种的潜在来源， 但被研究的最为清楚的就是肝星状细胞，在它们没有被活化成α平滑肌细胞骨架阳性表型的细胞之前，它们的主要功能是贮存维生素Α，调节维甲酸的水平。可一旦被活化后，它们就成为肝纤维化中纤维胶原的主要来源，而且它们通过收缩和释放致炎和致纤维因子，潜在的调节窦间隙的血流量。活化的星状细胞还能产生基质金属蛋白酶组织抑制剂，导致基质金属蛋白酶降解肝细胞外基质的功能受损，从而使细胞外基质向胶原和纤维化转变。随着RNAi作为制药技术的成熟，已有SiRNA药物进入临床实验，siRNA药物具有如下优点(1)、特异性强，碱基的顺序决定了它的特异性；(2)、设计便利，由于人类基因库已经完成，这为siRNA的设计带来了极大的便利，可以说几乎没有基因不能作为siRNA的靶标；03)、临床研究便利，siRNA药物作为核酸类药物，不管何种siRNA都具有大致相同的药物代谢，药物分布，药物毒性，这为进入临床研究带来了极大的便利；、由于RNAi —开始就已将特定基因作为靶标，所以siRNA分子药理学明确。
技术实现思路
本专利技术的目的在于利用RNAi (RNA干扰)技术，对候选的靶标基因进行效用、量效关系及特异性的评定，以提供能够抑制PAR-I (蛋白酶激活受体-1)基因表达的siRNA(小分子干扰RNA)，并进一步地提供该siRNA在临床上的应用。按照本专利技术提供的技术方案，所述siRNA为下述PAR-1-01 PAR-1-08中的任意一种，PAR-1-01 PAR-1-08 分别为PAR-1-01 正义链序列SEQIDNO.1为5'-AGGGCAGUCUACUUAAAUA-3‘反义链序列SEQIDNO.2为5，-UAUUUAAGUAGACUGCCCU-3 ’PAR-1-02 正义链序列SEQIDNO.3为5'-CGGCC⑶GGUGUACAUGCU-3‘反义链序列SEQIDNO.4为5'-AGCAUGUACACCACGGCCG-3 ‘PAR-1-03 正义链序列SEQIDNO.5为5'-CCUUCAAGAUCAGCUACUA-3‘反义链序列SEQIDNO.6为5'-UAGUAGCUGAUCUUGAAGG-3‘PAR-1-04 正义链序列SEQIDNO.7为5'-ACAUGUACGCCUCCAUCAU-3‘反义链序列SEQIDNO.8为5'-AUGAUGGAGGCGUACAU⑶-3‘PAR-1-05 正义链序列SEQIDNO.9为5'-GCAUCUUCAUC⑶CUGCUU-3‘反义链序列SEQIDNO.10 为 5'-AAGCAGACGAUGAAGAUGC-3‘PAR-1-06 正义链序列SEQIDNO.11 为 5'-CCACCAAC⑶CCUCCUGAU-3‘反义链序列SEQIDNO.12 为 5'-AUCAGGAGGAC⑶UG⑶GG-3‘PAR-1-07 正义链序列SEQIDNO.13 为 5'-GCAGGGCAGUCUACUUAAA-3‘反义链序列SEQIDNO.14 为 5'-UUUAAGUAGACUGCCCUGC-3‘PAR-1-08 正义链序列SEQIDNO.15 为 5'-GCUCUAGCCACCUGAAUAA-3‘反义链序列SEQIDNO.16 为 5'-UUAUUCAGGUGGCUAGAGC-3‘上述的各siRNA序列的3‘端垂悬两个dTdT，该垂悬不与mRNA序列互补，使正义链3'端更容易解链，从而增加其沉默效率。上述的各siRNA序列可用于制备治疗肝纤维化的药物。siRNA是RNAi途径中的中间产物，是RNAi发挥效应所必需的因子。siRNA的形成主要由Dicer和Rde-I调控完成。由于RNA病毒入侵、转座子转录、基因组中反向重复序列转录等原因，细胞中出现了 dsRNA，Rde-I (RNAi缺陷基因-1)编码的蛋白质识别外源 dsRNA,当dsRNA达到一定量的时候，Rde-I引导dsRNA与Rde-I编码的Dicer (Dicer是一种 RNaseIII活性核酸内切酶，具有四个结构域=Argonaute家族的PAZ结构域，III型RNA酶活性区域，dsRNA结合区域以及DEAH/DEXHRNA解旋酶活性区)结合，形成酶-dsRNA复合体。 在Dicer酶的作用下，细胞中的单链靶mRNA(与dsRNA具有同源序列)与dsRNA的正义链互换，原来dsRNA中的正义链被mRNA代替而从酶-dsRNA复合物中释放出来，然后，在ATP的参与下，细胞中存在的一种RNA诱导的沉默复合体RNA-induced silencing complex (RISC, 由核酸内切酶、核酸外切酶、解旋酶等构成，作用是对靶mRNA进行识别和切割)利用结合在其上的核酸内切酶的活性来切割dsRNA上处于原来正义链位置的靶mRNA分子中与dsRNA 反义链互补的区域，形成21-23nt的dsRNA小片段，这些小片段即为siRNA。RNAi干涉的关键步骤是组装RISC和合成介导特异性反应的siRNA蛋白。siRNA并入RISC中，然后与靶标基因编码区或UTR区完全配对，降解靶标基因，因此说siRNA只降解与其序列互补配对的 mRNA。其调控的机制是通过互补配对而沉默相应靶位基因的表达，所以是一种典型的负调控机制。siRNA识别靶序列是有高度特异性的。而且它的合成非常简便，已经成为一项很成熟的技术。本专利技术针对PAR-I基因设计合成了 8对siRNA，该8对siRNA能够有效抑制PAR-I 基因的表达；同时由于siRNA技术越来越成熟，也为治疗肝纤维化提供了可行的药物。附图说明图1为可见光源条件下的siRNA转染效率照片。图2为荧光激发条件下的siRNA转染效率照片。图3为荧光定量PCR检测转染不同siRNA的PAR-I基因表达水平图。图中M0CK是未转染任何siRNA的空白对照组；si-control是转染si-control的 siRNA 的无关对照组；PAR-1-01 PAR-1-08 是转染 PAR-1-01 PAR-1-08 的 本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：潘振华，张红，盛青松，
申请(专利权)人：无锡奥瑞生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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