人体液中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂Ｃ的测定方法技术

本发明专利技术针对大量使用特异性低的多克隆抗体、或特异性高但凝集性弱的单克隆抗体的以往的测定方法，提供了特异性高、成本低且容易实现自动化的人体液中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂Ｃ的颗粒增强免疫测定方法。所述人体液中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂Ｃ特异性的测定方法是组合了抗体致敏粒子的颗粒增强免疫测定方法，所述抗体致敏粒子是使高亲和性的抗人半胱氨酸蛋白酶抑制剂Ｃ单克隆抗体、和与其识别位点不同且亲和力相对弱的抗人半胱氨酸蛋白酶抑制剂Ｃ单克隆抗体分别独立地结合于不溶性载体粒子而得到的，相对于各种抗体致敏粒子的重量的抗人半胱氨酸蛋白酶抑制剂Ｃ单克隆抗体的结合量为小于５重量％。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及人体液中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的颗粒增强免疫测定方法及颗粒增强免疫测定试剂。
技术介绍
半胱氨酸蛋白酶抑制剂C是分子量为13kDa的碱性低分子蛋白质(等电点 PH9.幻，在全身的有核细胞中不断地产生，不受环境变化的影响而将一定量分泌到细胞外。 因此，血中浓度保持一定水平而不受其他的疾病导致的炎症等的影响或年龄、性别、运动、 饮食等的影响。另外，已知半胱氨酸蛋白酶抑制剂C不与其他的血浆蛋白质形成复合体，在肾小球过滤并在近曲小管重吸收，因此，如果肾小球滤过率(GFR)降低，则血中浓度上升， 从而作为代替肌酸酐来表示GFR的指标而受到关注。另外，由于在肾功能检查中，成为早期肾病的诊断指标，因此在门诊、健康诊断等领域中也广泛使用。作为半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的测定方法，报道了自动化的人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的颗粒增强免疫测定方法(非专利文献1 3、专利文献1)。例如，在非专利文献1 记载的方法中，凝集力强的抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂C多克隆抗体以5%的重量比与载体粒子结合来利用，但是如非专利文献4所示，由于对于半胱氨酸蛋白酶抑制剂C，存在结构类似的半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族群，且分布随着各种人体液的不同而不同，所以如果是特异性低的多克隆抗体，则由于人体液的种类(例如，唾液、泪液)而得不到正确的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的测定值的可能性极高。另一方面，在专利文献1中记载了一般而言，使用多克隆抗体容易形成免疫凝集体的内容(第20页第21-27行)。另外，虽然启示了特异性高的抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂C单克隆抗体的利用，但记载了将半胱氨酸蛋白酶抑制剂 C之类的单体且低分子量的蛋白质作为测定对象时，通过利用很多不同单克隆抗体的混合物可以得到良好结果的内容(第21页第5-10行)，实质上相当于利用了多克隆抗体。进而，如果为了提高性能而使抗体的结合量相对于抗体致敏粒子的总重量为大于5重量％且小于等于35重量％，则需要使明显大量的抗体结合。专利文献专利文献1 国际公开第2007/102054号小册子非专利文献非专利文献1 CLINICAL CHEMISTRY, Vol. 40，No. 10，(1994)，1921-1926非专利文献2 =KIDNEY INTERNATIONAL, Vol. 47，(1995)，312-318非专利文献3 CLINICAL CHEMISTRY, Vol. 43，No. 6，(1997)，1016-1022非专利文献4 :METH0DS IN ENZYM0L0GY, Vol. 224，(1994)，685-700
技术实现思路
在人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的颗粒增强免疫测定方法中通用的多克隆抗体存在特异性低、由于试样的种类而不能进行半胱氨酸蛋白酶抑制剂C特异性测定的问题。作3为其对策研究了单克隆抗体的利用，但由于凝集力弱，所以需要在不溶性载体粒子上大量结合由多种单克隆抗体组成的混合物，从而产生需要庞大的工作量和成本这样的新课题。 因此，目前仅由单克隆抗体组成的人体液中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的颗粒增强免疫测定方法尚没有被实用化。另外，在以往的人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的颗粒增强免疫测定方法中，为了得到实用的性能，需要相对于抗体致敏粒子的总重量的结合量为大于5重量％且小于等于35重量％这样大量的抗体。因此，本专利技术的课题是提供特异性高、成本低且容易自动化的人体液中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的颗粒增强免疫测定方法。本专利技术的专利技术人为了解决上述问题而进行了锐意研究，结果发现即便是在以往认为不适合半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的测定的单克隆抗体中，如果使高亲和性的抗人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C单克隆抗体、和与其识别位点不同的亲和力相对弱的抗人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C单克隆抗体，以相对于抗体致敏粒子的总重量小于5重量％的结合量比例分别独立结合，将所得的抗体致敏粒子进行组合，则可以进行半胱氨酸蛋白酶抑制剂C特异性的颗粒增强免疫测定，从而完成了本专利技术。即，本专利技术提供一种人体液中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的测定方法，其是组合了抗体致敏粒子的颗粒增强免疫测定方法，所述抗体致敏粒子是使高亲和性的抗人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C单克隆抗体、和与其识别位点不同且亲和力相对弱的抗人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C单克隆抗体分别独立地结合于不溶性载体粒子而得到，相对于各种抗体致敏粒子的总重量的抗人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C单克隆抗体的结合量为小于5重量％。另外，本专利技术提供人体液中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C特异性的颗粒增强免疫测定试剂，其是使高亲和性的抗人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C单克隆抗体、和与其识别位点不同且亲和力相对弱的抗人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C单克隆抗体分别独立地结合于不溶性载体粒子而得到的抗体致敏粒子的组合，含有相对于各种抗体致敏粒子的总重量的抗人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C单克隆抗体的结合量为小于5重量％的抗体致敏粒子。根据本专利技术，可以提供比以往特异性高、成本低且容易适应自动分析装置的人体液中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的颗粒增强免疫测定方法及试剂。附图说明图1是表示按照a-b、a-d、b-d将同一粒径的抗体致敏乳胶粒子彼此组合来测定半胱氨酸蛋白酶抑制剂C时，伴随颗粒增强免疫凝集的灵敏度的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C浓度-灵敏度曲线，所述抗体致敏乳胶粒子是将抗人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C单克隆抗体a、 b、d分别结合于粒径为0. 13 μ m、0. 30 μ m的乳胶粒子而得到的。图2是表示以ELISA法确认的抗人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C单克隆抗体、以及作为对照的抗人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C多克隆抗体的特异性的图。图3是本专利技术试剂与对照试剂的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C测定相关图(样本数N =50)。图4是表示本专利技术试剂与对照试剂的检测限浓度的图。具体实施方式本专利技术中使用的抗人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C单克隆抗体是2种以上，含有与人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C特异性地反应且高亲和性的单克隆抗体和与其识别位点不同且亲和力相对弱的单克隆抗体各1种以上。此外，上述抗体还包括含功能部位的抗体片段 (即，含有人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C识别位点Fab的抗体片段)、重组抗体(即，重组了 Fab以外的结构的抗体)。对于获得上述高亲和性的单克隆抗体的方法没有进行特别的限定，但是对免疫部位或融合细胞的选择、免疫的人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的增加量、免疫期间的延长等对获得高亲和性的抗体有效。在此，所谓的与人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C特异性地反应是指与人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C发生抗原抗体反应，但是与其他的半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族(例如人半胱氨酸蛋白酶抑制剂A、半胱氨酸蛋白酶抑制剂B、半胱氨酸蛋白酶抑制剂D、 半胱氨酸蛋白酶抑制剂E/M、半胱氨酸蛋白酶抑制剂F、半胱氨酸蛋白酶抑制剂S、半胱氨酸蛋白酶抑制剂SA、激肽原等)实质上不发生抗原抗体反应。在本专利技术使用的抗人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C单克隆抗体中，高亲和性的抗人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C单克隆抗体，例如根据“商品名=BIACore (注册商标，GE Healthcare 公司制)”装置上的滴度测定算出的解离常数(kd值)小于InM、优选为0.5nM以下。需要说明的是，在利用BIACore装置的解析中，一般亲和力的单克隆抗体的解离常数为InM以上。作为解离常数的确定方法，只要是在该本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种人体液中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂Ｃ测定方法，其特征在于，是使用了抗体致敏粒子的颗粒增强免疫测定方法，所述抗体致敏粒子是使高亲和性的抗人半胱氨酸蛋白酶抑制剂Ｃ单克隆抗体、和与其识别位点不同且亲和力相对弱的抗人半胱氨酸蛋白酶抑制剂Ｃ单克隆抗体分别独立地结合于不溶性载体粒子而得到的，抗人半胱氨酸蛋白酶抑制剂Ｃ单克隆抗体的结合量相对于各种抗体致敏粒子的总重量为小于５重量％。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：中山真也，
申请(专利权)人：积水医疗株式会社，
类型：发明
国别省市：JP