克隆禽源抗体的方法技术

本发明专利技术系关于使来自富含特定表面抗原标记之禽细胞之群体之ＶＨ与ＶＬ编码序列的同源对连接的程序。该连接程序包括能够伴随扩增使目标核苷酸序列连接的多重分子扩增程序（多重ＰＣＲ）。该方法特别有利于形成来自鸡或其它禽之抗体可变区编码序列之同源对文库及组合文库。本发明专利技术亦提供形成嵌合性人类／禽抗体的方法及藉由此等方法所形成的表达文库。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术系关于使来自富含特定表面抗原标记之衍生自禽之细胞之群体之抗体重 链与轻链编码序列的同源对(cognate pair)连接的方法。该方法涉及与扩增(尤其聚合 酶链反应)关联的多重分子扩增程序(多重PCR)，其能连接多个目标核苷酸序列。该方法 特别有利于形成来自免疫球蛋白之可变区编码序列之同源对文库及组合文库。本专利技术亦关 于形成嵌合性人类/禽抗体的方法及藉由此等方法所形成的表达文库。
技术介绍
WO 2005/042774揭示使用多重分子程序使目标核苷酸序列、尤其抗体重链可变区 与轻链可变区(Vh与VJ编码序列的同源对连接的方法。较佳在有限稀释技术或其它细胞 分离技术后扩增并连接衍生自经分离的单细胞的目标序列。此文献揭示富集含淋巴细胞之 细胞群体以获得特别适用于多重分子扩增程序之产生/编码抗体之细胞(例如浆细胞)群 体的多种方式。WO 2008/104184揭示使用多重扩增程序形成小鼠或其它啮齿类动物之免疫球蛋 白编码序列文库的方法，该程序系针对富含表面抗原⑶43及⑶138或MHCII及B220之经 分离的单细胞的群体所进行。此等文献中所述的方法(通常称为Symplex 技术)特别适合于形成衍生自人类 细胞或衍生自小鼠或其它啮齿类动物细胞之可变区编码序列的同源对文库。然而，此等文 献未解决自鸡或其它禽类细胞形成同源对文库或组合文库的问题。若一方面人类之间且另 一方面鸡或其它禽类之间存在系统发生差异，则旨在形成禽抗体或较佳人类/禽嵌合抗体 的此方法值得关注。原因在于，治疗多种人类疾病及病症的治疗性抗体通常形成于小鼠中， 但由于小鼠与人类相对而言为密切相关物种，因此可能存在针对人类抗原的最佳抗体不能 形成于小鼠或其它哺乳动物物种中的人类疾病及病症。对于靶向人类自体抗原、旨在治疗 癌症或自体免疫疾病的抗体，尤其如此。在此等情况下，能够自与人类系统发生关系远的物 种(诸如鸡或其它禽类)分离出目标抗体可为有利的。本专利技术解决如何分离可产生用作人 类治疗剂之潜在受关注抗体的禽细胞的问题，以便能够最终鉴别新颖且有用的抗体疗法。专利技术概述本专利技术集中在形成来自禽类之免疫球蛋白编码序列之文库的方法及形成编码包 含人类恒定区及禽可变区之嵌合抗体之载体之文库的方法。本专利技术之方法包括相对较少的 步骤且适用于高产量筛检及克隆。在一方面，本专利技术系关于产生包含经连接之可变区编码序列之同源对之文库的方 法，该方法包含a)提供来自禽起源之供体的包含淋巴细胞之细胞级分；b)藉由将来自该细胞级分之细胞单个地分布于多个容器中来获得经分离的单细 胞的群体，其中至少一个细胞亚群表达免疫球蛋白基因，较佳为IgY，及可选地表达禽B细 胞标记抗原；及 c)扩增该经分离的单细胞的群体中所包含的可变区编码序列并连接该等可变区 编码序列，其藉由使用衍生自经分离的单细胞或同基因细胞(isogenic cells)之群体之模 板以多重分子扩增程序扩增目标核苷酸序列，并连接所扩增之目标核苷酸序列。 此方法提供同源对抗体或抗体片段之文库。在另一方面，本专利技术系关于使多个非邻接的目标核苷酸序列随机连接的方法，该 方法包含a)使用衍生自遗传多样性细胞之群体之模板以多重分子扩增程序扩增目标核苷 酸序列，其中该等遗传多样性细胞衍生自来自禽起源之包含淋巴细胞的细胞级分，且其中 至少一个细胞亚群表达免疫球蛋白基因，较佳为IgY，及可选地表达禽B细胞标记抗原；及b)连接步骤a)中所扩增之目标核苷酸序列。此方法提供随机组合之重链与轻链可变区编码域之组合文库。本专利技术表达免疫球蛋白之细胞亚群之特征尤其可为以下任一者且其可针对以下 任一者评估且/或富集 表达 IgY (IgY+);·表达 IgY，且 CD3 为阴性(IgY+CD3_)；·表达IgY，不表达或低量表达Bu-Ι，且CD3为阴性(IgY+Bu-rCD3_)；·表达 Bu-I 与 IgY (Bu-I+IgY+)；·表达 Bu-I 与 IgY，且 CD3 为阴性(Bu_l+IgY+CD3)；·表达Bu-I，但不表达任何单核细胞标记(Bu-Γ，单核细胞_)；·表达Bu-I，且不表达或低量表达IgM(Bu-l+IgM_)；或·表达 Bu-I 与 BAFF (Bu-I+BAFF+)。细胞亚群之特征尤其为表达禽免疫球蛋白IgY。此亚群之特征可进一步为表达和 /或不表达一或多种禽B细胞标记抗原，可预期，表达免疫球蛋白基因(诸如IgY)的细胞亚 群亦表达可侦测量之至少一种禽B细胞标记抗原。因此亚群可依据一或多种禽B细胞标记 抗原(诸如Bu-1、CD3、IgM或BAFF)之表达，可选地特定量之表达，和/或不表达，而加以 定义。在一特定具体实例中，亚群之特征系表达IgY及⑶3为阴性(⑶3_;亦即不表达⑶3 或⑶3表达可忽略)。在另一特定具体实例中，亚群之特征系表达IgY、不表达或低量表达 Bu-Ι、及CD3为阴性。其它目标标记抗原亦可包括人类B细胞标记(诸如⑶19、⑶20、⑶27、⑶38或 ⑶45)之禽直系同源物；或鼠科B细胞标记(诸如MHCII、B220、⑶43或⑶138)之禽直系同 源物；或此等标记之组合。本申请案中所提供的实验数据证实，基于IgY表达而自衍生自鸡 之脾细胞分离且视情况针对表面抗原(诸如Bu-I及/或CD3)之表达或不表达而分选的细 胞群体为使用多重分子扩增方法克隆抗体编码序列提供良好的起始物质。本专利技术之方法可 轻易应用于表达IgY之直系同源物及可选地表达其它禽B细胞标记抗原的其它物种。该等 方法尤其可应用于其它禽物种，例如鸭、鹅、鸽或火鸡。此外，本专利技术之方法提供可轻易测序及/或插入载体(诸如表达载体、转移载体、 展示载体或穿梭载体)中之多核苷酸之文库，以便一旦选择特定抗体后便可克隆其，测定 其序列且可轻易将其转移至适当表达载体中以用于制备重组抗体。预期根据本文中所揭示之方案分选的细胞能够提供潜在具有皮莫耳浓度范围内之亲和力的高亲和力抗体来源。来自杂交瘤的单克隆抗体可能不具有皮莫耳浓度范围内的 亲和力，且因而需要以合成方式进行亲和力成熟以达到此等亲和力。在一具体实例中，此等方法还包含在多重分子扩增之前评估包含淋巴细胞之细胞 之群体包含根据上述标准由禽免疫球蛋白基因(尤其IgY)之表达及可选地一或多种禽B 细胞表面标记(较佳CD3及/或Bu-I)之表达(表达之存在或不存在，或特定表达量)所 定义的细胞，例如该群体包含表达可侦测量之IgY及/或Bu-I的细胞。又，该等方法可包 括在多重分子扩增之前为该包含淋巴细胞之细胞级分富集淋巴细胞群体，该淋巴细胞群体 系依据表达IgY及表达及/或不表达禽类B细胞表面标记(较佳为如上所述之CD3及/或 Bu-I)之一或其组合所定义，例如富集表达IgY且特征为表达或不表达例如Bu-I及/或CD3 的细胞。在一特定具体实例中，群体系针对表达IgY的细胞而评估及/或富集。在特定具 体实例中，群体可针对表达IgY且⑶3为阴性、或表达IgY与Bu-1、或表达IgY且不表达或 低量表达Bu-I的细胞而评估及/或富集。该等方法较佳还包含在多重分子扩增之前自该包含淋巴细胞之群体分离表达免 疫球蛋白基因及禽B细胞抗原的单细胞。在一较佳具体实例中，经分离的单细胞或细胞亚 群之特征系IgY、Bu-l本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．产生同源对之文库的方法，所述同源对包含多个相连的可变区编码序列，所述方法包含：ａ）提供来自禽供体的包含淋巴细胞的细胞级分；ｂ）将来自该细胞级分之细胞单个地分布于一组容器中，获得一群分离的单细胞，其中至少一个细胞亚群表达免疫球蛋白基因及可选地表达禽Ｂ细胞标记抗原；及ｃ）扩增、并连接该经分离的单细胞的群体中所含的可变区编码序列，方法是，用衍生自经分离的单细胞或一群同基因细胞的模板，以多重分子扩增程序，扩增目标核苷酸序列；并对这些扩增得到的目标核苷酸序列进行连接。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：拉斯·S·尼尔森，
申请(专利权)人：西福根有限公司，
类型：发明
国别省市：DK