【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及免疫化学
,尤其涉及一种抗磺胺类兔单克隆抗体的制备方法 及其用途。
技术介绍
磺胺类药物(Sulfonamides,SAs)是指具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总 称,具有广谱抗菌活性,能抑制大多数革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌及原生动物,被广泛地 应用于人和动物细菌性疾病的治疗和预防。在预防动物疾病的同时,SAs还可提高饲料转 化率,促进动物生长,被用作动物饲料添加剂。与此同时SAs具有性质稳定、价格低廉、使用 方便等特点,而广泛地应用于兽药临床、动物饲料添加剂、水产养殖等领域。SAs经各种途径进入动物体内后,可转移到肉、蛋、乳等动物性食品中,如不合理使 用易在动物性食品中残留,对人类的健康产生潜在的危险,如细菌耐药性的增加、对机体产 生毒害作用甚至引发癌变,并适成生态环境污染。近年来随着磺胺类药物(Sulfonamides,SAs)在临床上的大量广泛使用,其残留 问题也越来越严重。在国内外用于SAs药物残留检测的方法较多,有微生物法、免疫分析测 定法、高效液相色谱法、高效毛细管电泳法、液相色谱_质谱_质谱法、薄层色谱法、荧光分 光光度法等。免疫分析测定法适用于大规模检测和筛选。ELISA方法灵敏度较高,特异性较 强,测定方法简单快速,可同时筛选大量样品。目前常将ELISA法作为筛选法,高效液相色 谱_质谱法作为确证方法配套使用。兔单克隆抗体较常规的鼠单克隆抗体具有更多优点。首先,兔子相比于小鼠能识 别更多免疫抗原的表位。其次,由于兔脾脏较大,可以进行更多的融合实验,使得高通量筛 选融合细胞成为可能。本专利技术通过杂交瘤技术得到抗磺胺 ...
【技术保护点】
一种抗磺胺类兔单克隆抗体的制备方法,其特征在于它的步骤如下:1)将10mg磺胺甲恶唑加入到2ml的1mol/L HCL中,70℃加热溶解,冰浴冷却后,滴加到0.4ml的0.2mol/L NaNO↓[2],反应30min,得到重氮化的磺胺甲恶唑;将25mg牛血清白蛋白溶解于2ml的0.05mol/L碳酸盐缓冲液中,得到牛血清白蛋白溶液,重氮化的磺胺甲恶唑滴加到预冷后的牛血清白蛋白溶液中,用2mol/L NaOH调节pH值至9.0,4℃磁力搅拌6h,用磷酸盐缓冲液4℃搅拌下透析,得到磺胺甲恶唑免疫抗原,-20℃存放;2)将磺胺嘧啶40mg溶解于1M的NaOH中,加入1ml的1%NaNO↓[2],得到磺胺嘧啶溶液,冰水浴,磁力搅拌下,将磺胺嘧啶溶液滴加到2.4mL的1mol/L HCL中,反应10min,得到重氮化的磺胺嘧啶;将100mg的牛血清白蛋白,溶解于8mL,0.05mol/L碳酸盐缓冲液中,得到牛血清白蛋白溶液,将重氮化的磺胺嘧啶滴加到牛血清白蛋白溶液中,用NaOH调节pH值到9.5,4℃磁力搅拌6h,用磷酸盐缓冲液4℃搅拌下透析,得到磺胺嘧啶免疫抗原,-20℃存放;3)将磺胺甲恶 ...
【技术特征摘要】
一种抗磺胺类兔单克隆抗体的制备方法,其特征在于它的步骤如下1)将10mg磺胺甲恶唑加入到2ml的1mol/L HCL中,70℃加热溶解,冰浴冷却后,滴加到0.4ml的0.2mol/L NaNO2,反应30min,得到重氮化的磺胺甲恶唑;将25mg牛血清白蛋白溶解于2ml的0.05mol/L碳酸盐缓冲液中,得到牛血清白蛋白溶液,重氮化的磺胺甲恶唑滴加到预冷后的牛血清白蛋白溶液中,用2mol/L NaOH调节pH值至9.0,4℃磁力搅拌6h,用磷酸盐缓冲液4℃搅拌下透析,得到磺胺甲恶唑免疫抗原, 20℃存放;2)将磺胺嘧啶40mg溶解于1M的NaOH中,加入1ml的1%NaNO2,得到磺胺嘧啶溶液,冰水浴,磁力搅拌下,将磺胺嘧啶溶液滴加到2.4mL的1mol/L HCL中,反应10min,得到重氮化的磺胺嘧啶;将100mg的牛血清白蛋白,溶解于8mL,0.05mol/L碳酸盐缓冲液中,得到牛血清白蛋白溶液,将重氮化的磺胺嘧啶滴加到牛血清白蛋白溶液中,用NaOH调节pH值到9.5,4℃磁力搅拌6h,用磷酸盐缓冲液4℃搅拌下透析,得到磺胺嘧啶免疫抗原, 20℃存放;3)将磺胺甲恶唑免疫抗原和磺胺嘧啶免疫抗原,采用背部皮下注射混和免疫兔子,免疫前取血2ml,第一次免疫将两种免疫抗原各0.5mg与等量弗氏完全佐剂混和后进行免疫,第二次至第五次免疫将两种免疫抗原各0.25mg与等量弗氏不完全佐剂混和后进行免疫,免疫间隔两周,加强免疫安排在第五次免疫后的4 8周内,将两种免疫抗原各0.5mg混和后静脉注射,注射后4天杀兔子,取脾备用;4)无菌取脾脏,分离脾脏细胞,分离脾脏细胞的步骤为在培养皿中去除脾脏周围的脂肪和其他组织;用1640培养液冲洗后,将脾脏置于不锈钢筛网上,挤压过筛;用1640培养液悬浮后离心,1400rpm,5min;弃上清,重复洗涤一次;用1640培养液重悬细胞,取少量细胞悬液稀释;用台盼蓝染色计算活细胞数;根据细胞计数,取含2×108个脾淋巴细胞的悬液备用;5)将脾脏细胞与240E细胞进行细胞融合,240E细胞是在细胞融合实验前一周传代培养的,融合当天收集生长旺盛、正处于对数生长期的240E细胞与免疫兔子的脾细胞融合,融合剂为50%的聚乙二醇,细胞融合前取2...
【专利技术属性】
技术研发人员:郑晓冬,刘娜,陆蕾,倪庚,
申请(专利权)人:浙江大学,
类型:发明
国别省市:86[中国|杭州]
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